造血干細胞移植對卵巢結(jié)構(gòu)與功能影響的研究.pdf

1、目的隨著造血干細胞移植技術(shù)(Hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT)逐步應(yīng)用于臨床，成為治療血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病和基因缺陷疾病的重要手段，HSCT治療過程中所致的醫(yī)源性損害及其防治問題也逐漸得到重視。研究發(fā)現(xiàn)：造血干細胞移植后的女性患者可出現(xiàn)閉經(jīng)、不孕等卵巢功能衰退的表現(xiàn)，過去的研究認為這種損害可能單純由移植前的放射治療或化學藥物預(yù)處理引起，但最近的臨床觀察發(fā)現(xiàn)其損傷還可能與免疫因素有

2、關(guān)，尤其是移植后引起的移植物抗宿主病(Graft-versus-hostdisease，GVHD)可通過激活T淋巴細胞，導致機體免疫功能紊亂，從而加重對卵巢的損害。目前有關(guān)造血干細胞移植引起卵巢損害方面的研究還不多，且多為臨床觀察性資料，而其具體機理還不十分清楚。因此，本課題通過兩部分研究來探討造血干細胞移植對卵巢結(jié)構(gòu)和功能的影響，并初步探索其發(fā)生的可能機理。第一部分通過臨床研究，即在相同化學藥物預(yù)處理條件下，以正常同年齡段婦女為對照，

3、觀測造血干細胞移植時不同的移植方式及移植物抗宿主病對生育年齡婦女卵巢功能的影響。鑒于醫(yī)學倫理學原因，臨床上未能設(shè)立單純化學藥物預(yù)處理組作為對照，且未能取卵巢組織對移植后卵巢結(jié)構(gòu)改變進行研究，使臨床研究具有一定局限性，因此我們進一步設(shè)計了第二部分動物實驗，通過小鼠自體及同種異基因造血干細胞移植模型，觀測單純使用化學藥物預(yù)處理、自體或同種異基因造血干細胞移植后小鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)及功能的變化，并用免疫組化法檢測卵巢淋巴細胞浸潤情況，以研究化學藥

4、物預(yù)處理、自體或同種異基因造血干細胞移植對卵巢的損害程度，并初步分析其發(fā)生的可能機理。 方法： 第一部分：臨床研究 臨床觀察45例因急性非淋巴細胞性白血病分別接受自體造血干細胞移植(Autologoushematopoieticstemcelltransplantation，Auto-HSCT)(23例)和同種異基因造血干細胞移植(Allogeneichematopoieticstemcelltransplant

5、ation，Allo-HSCT)(22例)患者的月經(jīng)情況，采用經(jīng)陰道B超監(jiān)測卵巢及子宮大小、卵泡發(fā)育情況和子宮內(nèi)膜厚度，放射免疫法檢測血清E2、P、FSH、LH、T、PRL變化。同時隨機抽取45名同年齡段健康婦女作為對照。 第二部分：動物實驗 以正常成年雌性BALB/C(H-2d)小鼠建立自體和同種異基因造血干細胞移植模型。實驗分為5組(每組20只)：空白組(A組)；對照組(B組)；化學藥物預(yù)處理組(C組)；Auto-H

6、SCT組(D組)和Allo-HSCT組(E組)。每天陰道涂片檢測小鼠動情周期，觀察移植組造血干細胞植入成功和GVHD發(fā)病情況。于預(yù)處理后15d每組隨機取10只(空白組和對照組于第2個間情期)處死，其余小鼠于預(yù)處理后30d(空白組和對照組于第4個間情期)處死，右心取血，取出子宮稱重，在光鏡和電鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學變化，放射免疫法檢測血清E2、P、FSH、LH、T、PRL水平；免疫組織化學染色檢測皮下組織和卵巢組織中CD3和F4/80的表

7、達，了解組織中是否有淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。 結(jié)果 第一部分：臨床研究 移植組月經(jīng)情況調(diào)查結(jié)果：所有患者均在移植前化學藥物預(yù)處理后出現(xiàn)閉經(jīng)。Auto-HSCT組有4人恢復(fù)月經(jīng)，而Allo-HSCT僅有2人恢復(fù)。月經(jīng)恢復(fù)婦女的移植時年齡顯著小于持續(xù)閉經(jīng)的患者(P＜0.05)。B超下觀察卵巢和子宮發(fā)現(xiàn)：Auto-HSCT和Allo-HSCT組患者的子宮和卵巢均明顯縮小，卵泡數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜變薄。但Auto-HSCT

8、組損害顯著輕于Allo-HSCT組，(P＜0.05)；Allo-HSCT組中，發(fā)生GVHD的婦女卵巢和子宮顯著小于未發(fā)生GVHD者，發(fā)育卵泡數(shù)顯著減少，子宮內(nèi)膜更薄，(P＜0.05)。激素水平檢測顯示：移植后婦女E2、和P水平均顯著低于對照組，F(xiàn)SH、LH水平顯著增高，(P＜0.05)；Auto-HSCT組卵巢功能的損害明顯輕于Allo-HSCT，Allo-HSCT組中，伴有GVHD的患者E2、P和T水平均顯著低于無GVHD者，F(xiàn)SH水

9、平顯著高于無GVHD者，(P＜0.05)。Auto-HSCT組血清T水平與正常組間無顯著性差異，(P＞0.05)；而Allo-HSCT進一步影響到血清T水平，使其顯著下降。各組間PRL水平無顯著性差異。 第二部分動物實驗 于造血干細胞移植后第3天白細胞和紅細胞較移植前顯著上升，表明移植成功。實驗組中，小鼠于化學藥物預(yù)處理后第1天均出現(xiàn)精神委靡、皮毛蓬松、反應(yīng)遲鈍、體重下降等表現(xiàn)。Allo-HSCT組中有14只小鼠出現(xiàn)GV

10、HD癥狀，皮膚病理檢查有淋巴細胞浸潤，皮下組織免疫組化檢查可見T淋巴細胞浸潤。陰道涂片檢查顯示預(yù)處理組、自體移植組和異體移植組所有小鼠均在預(yù)處理后第1天開始陰道上皮細胞失去周期性變化。預(yù)處理組中有3只、自體移植組有4只、異體移植組僅有1只小鼠恢復(fù)動情周期。預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT子宮重量較對照組顯著減輕，(P＜0.01)，未發(fā)生GVHD的小鼠在移植后逐漸恢復(fù)，伴有GVHD的Allo-HSCT小鼠隨病情的發(fā)展子宮

11、重量進一步減輕。預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組卵巢體積縮小，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后卵泡的顆粒細胞變性、壞死，卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡增加，間質(zhì)細胞形態(tài)正常；伴有GVHD的小鼠卵巢組織破壞加重，其間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組沒有發(fā)生GVHD的小鼠始基卵泡數(shù)與對照組比較無明顯差異，其余各級卵泡如初級卵泡，次級卵泡、竇狀卵泡顯著減少，(P＜0.01)，閉鎖卵泡增加(P＜

12、0.01)。而移植后發(fā)生GVHD的小鼠各期卵泡數(shù)顯著少于未發(fā)生GVHD的小鼠，閉鎖卵泡增加，(P＜0.01)；尤其是接受Allo-HSCT后發(fā)生GVHD的30d小鼠卵泡數(shù)減少最顯著，(P＜0.01)，始基卵泡明顯受損。電鏡觀察：預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組小鼠卵母細胞、顆粒細胞均受到不同程度損傷，可見卵母細胞體積減小，周邊的顆粒細胞染色質(zhì)凝聚成塊，線粒體體積變小，顆粒細胞點狀壞死，見凋亡小體，分泌現(xiàn)象消失，脂質(zhì)空

13、泡減少，但透明帶保持完整。Allo-HSCT組中伴有GVHD的小鼠卵母細胞和顆粒細胞壞死嚴重，可見大量髓鞘樣結(jié)構(gòu)，30d小鼠發(fā)生GVHD者還可見透明帶斷裂。Allo-HSCT組中發(fā)生GVHD的15d小鼠卵巢中CD3為陽性，表明有T淋巴細胞浸潤，未見淋巴肉芽腫；30d小鼠CD3為陽性，其卵巢間質(zhì)中可見淋巴肉芽腫，并且F4/80染色陽性，表明有巨噬細胞浸潤。生殖內(nèi)分泌激素水平檢測顯示：預(yù)處理組、Auto-HSCT組和Allo-HSCT組E2

14、、P較對照組顯著下降，(P＜0.01)，F(xiàn)SH、LH顯著增高，(P＜0.01)；與其他各組比較，Allo-HSCT組T水平顯著降低，(P＜0.05)；Allo-HSCT組中30d小鼠發(fā)生GVHD者血清E2、P、T水平下降最明顯，(P＜0.01；P＜0.05)。FSH、LH顯著增高，(P＜0.01)；PRL水平在各組之間無顯著性差異，(P＞0.05)。 結(jié)論 1.臨床研究發(fā)現(xiàn)造血干細胞移植可使婦女閉經(jīng)，血清E2和P水平下降

15、，子宮及卵巢體積減小，子宮內(nèi)膜變薄，提示造血干細胞移植致卵巢功能下降，可能與卵巢結(jié)構(gòu)受損有關(guān)。 2.部分未發(fā)生GVHD的婦女移植后可自然恢復(fù)月經(jīng)。年輕者月經(jīng)較易恢復(fù)，表明移植時年齡可能是月經(jīng)恢復(fù)的影響因素之一。 3.動物實驗觀察到造血干細胞移植使卵巢中發(fā)育卵泡數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)破壞，閉鎖卵泡增多，血清E2、P水平下降，證實造血干細胞移植導致卵巢結(jié)構(gòu)和功能受損。 4.自體和同種異基因造血干細胞移植未發(fā)生GVHD的小鼠，

16、其始基卵泡和間質(zhì)細胞未受損，部分小鼠動情周期自行恢復(fù)，30d小鼠卵巢損傷明顯減輕，表明隨時間的延長卵巢損傷可在一定程度上有所恢復(fù)，與臨床觀察結(jié)果一致。 5.自體和同種異基因造血干細胞移植未發(fā)生GVHD的小鼠其卵巢損傷的程度與單純化學藥物預(yù)處理者相同，表明其卵巢損傷的原因主要由移植前化學藥物預(yù)處理引起。 6.同種異基因造血干細胞移植后的小鼠，其卵巢結(jié)構(gòu)與功能的損害重于自體造血干細胞移植者，伴發(fā)GVHD時，卵巢組織中存在T淋