乙體氯氰菊酯對(duì)大鼠腦組織谷氨酸-谷氨酰胺環(huán)路的干擾及其機(jī)制探討.pdf

1、前言
　　 擬除蟲菊酯(pyrethroid,PD)是根據(jù)天然除蟲菊素的結(jié)構(gòu)人工合成的農(nóng)藥,因具有廣譜、高效、低毒、低殘留等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。大量研究表明,該類藥物屬于神經(jīng)毒物,中毒時(shí)主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的強(qiáng)烈興奮癥狀。
　　 以往對(duì)PD神經(jīng)毒性研究主要集中在膜電壓依賴性離子通道、信號(hào)傳導(dǎo)及中樞神經(jīng)遞質(zhì)等多個(gè)靶位點(diǎn)上。研究發(fā)現(xiàn),PD可致腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamate,Glu)含量增加,與突觸后膜上的谷氨酸

2、受體的結(jié)合明顯增多,進(jìn)而引發(fā)一系列生化級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而PD如何致突觸間隙Glu增多至今尚未闡明。
　　 Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性突觸傳遞的主要神經(jīng)遞質(zhì)。星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間形成的谷氨酸-谷氨酰胺(glutamate-glutamine,Glu-Gln)環(huán)路是腦內(nèi)Glu代謝的主要途徑,谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和谷氨酰胺酶則是此環(huán)路中合成和水解Glu的關(guān)鍵酶。釋放致突觸間

3、隙的Glu主要通過谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glutamate transporter-1,GLT-1)以重?cái)z取方式清除而維持間隙內(nèi)Glu的正常濃度。因此,Glu-Gln環(huán)路在PD致Glu遞質(zhì)傳遞紊亂的興奮性神經(jīng)毒性中起著至關(guān)重要的作用。此外,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量約為神經(jīng)元的10倍,并且介于神經(jīng)元和毛細(xì)血管之間,是血腦屏障的重要組成部分,血液中的PD或代謝產(chǎn)物只有通過星形膠質(zhì)細(xì)胞才能作用于神經(jīng)元。因此,PD致突觸間隙Glu增多可能與清除功能下降有關(guān)

4、,星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的GS和(或)其膜上的GLT-1可能是PD干擾Glu-Gln環(huán)路代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn),溴氰菊酯染毒大鼠海馬和皮質(zhì)突觸體GLT-1對(duì)Glu的攝取功能降低,但作用機(jī)制尚不清楚,有關(guān)PD對(duì)Glu-Gln環(huán)路干擾的詳細(xì)研究也未見報(bào)道。
　　 乙體氯氰菊酯(beta-cypermethrin,β-CP)又名高效氯氰菊酯,是目前應(yīng)用較為廣泛的Ⅱ型PD類農(nóng)藥。因此,本研究通過β-CP對(duì)大鼠腦組織Glu-Gln環(huán)路干擾的研究

5、,探討PD興奮性神經(jīng)毒性及其作用機(jī)制,為該類農(nóng)藥的中毒防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 一、動(dòng)物分組及染毒
　　 健康成年Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為4組,每組10只,雌雄各半。以一次經(jīng)口灌胃方式分別給予0、20、40、80mg/kg劑量的β-CP,灌胃量為0.5ml/100g體重。以食用色拉油稀釋受試物質(zhì),對(duì)照組給予等量色拉油。實(shí)驗(yàn)期間自由攝食及飲水,4h后乙醚麻醉處死大鼠,分離大鼠腦組織供試。

6、r>　　 二、觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法
　　 (一)癥狀觀察
　　 染毒后連續(xù)觀察并記錄大鼠中毒狀況出現(xiàn)的時(shí)間、中毒表現(xiàn)及死亡情況。
　　 (二)Glu及Gln水平
　　 應(yīng)用分光光度法按試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。
　　 (三)GS活性及GLT-1的蛋白表達(dá)
　　 1、GS活性
　　 用預(yù)冷生理鹽水將腦組織制成1％勻漿液,超聲處理后參照文獻(xiàn)測(cè)定腦組織GS活性。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。GS活

7、性檢測(cè)結(jié)果以每分鐘每毫克組織蛋白催化生成的γ-谷氨酰異羥肟酸的nmol數(shù)表示。
　　 2、GLT-1的蛋白表達(dá)
　　 利用RIPA蛋白裂解液提取腦組織總蛋白,紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提蛋白溶液濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)印,封閉,TBS-T洗膜,一抗4℃過夜,TBS-T洗膜,二抗孵育2h,TBS-T洗膜,ECL法顯色成像。利用圖像分析軟件,用所測(cè)蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

8、　　 (四)GS、GLT-1的mRNA表達(dá)
　　 用TRIzol試劑提取腦組織中的總RNA,按RT-PCR試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增GS、GLT-1 mRNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析照相,利用軟件分析各條帶的灰度值,以各目的基因產(chǎn)物灰度值與β-actin灰度值的比值作為各目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 三、統(tǒng)計(jì)分析
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(x)±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,

9、組間兩兩比較用LSD法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果
　　 一、癥狀觀察
　　 80mg/kg劑量組全部大鼠于染毒1h后出現(xiàn)舔身、不安、抓搔等輕微興奮癥狀,2h后陸續(xù)出現(xiàn)流涎、痙攣、共濟(jì)失調(diào)等中毒癥狀,其中1只雌鼠出現(xiàn)瀕死狀態(tài)；40mg/kg劑量組個(gè)別大鼠于染毒2h后出現(xiàn)輕微興奮癥狀；20mg/kg劑量組大鼠在整個(gè)受試期間未見異常。實(shí)驗(yàn)期間無動(dòng)物死亡。
　　 二、Glu及Gln水平
　　 大

10、鼠腦組織Glu水平隨染毒劑量的增加而逐漸增加。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,80mg/kg劑量組大鼠腦組織Glu水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；20、40mg/kg劑量組大鼠腦組織Glu水平雖高于對(duì)照組,但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 各染毒組大鼠腦組織Gln水平與對(duì)照組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 三、GS活性及GLT-1的蛋白表達(dá)
　　 β-CP染毒大鼠腦組織GS活性隨著染毒劑量的增加而

11、逐漸降低,其中80mg/kg劑量組大鼠腦組織GS活性明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；20、40mg/kg劑量組大鼠腦組織GS活性雖低于對(duì)照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,各染毒組大鼠腦組織GLT-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 四、GS、GLT-1的mRNA表達(dá)
　　 各組大鼠腦組織中GS、GLT-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0