膀胱癌發(fā)生發(fā)展特異相關(guān)基因的克隆與鑒定.pdf

1、第一部分：激光捕獲顯微切割技術(shù)聯(lián)合RNA體外線性擴(kuò)增技術(shù)獲得均質(zhì)性實(shí)驗(yàn)樣品 目的：(1)改進(jìn)文獻(xiàn)報(bào)道的激光捕獲顯微切割(LCM)方法、步驟，確定一套適合于捕獲膀胱正常移行細(xì)胞及膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞的技術(shù)路線；(2)獲得均質(zhì)性膀胱正常移行細(xì)胞及膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞TotalRNA及高質(zhì)量、充足的aRNA，以備進(jìn)一步用于膀胱癌相關(guān)基因研究；(3)確定LCM過程中激光激發(fā)次數(shù)(shootings)與獲得膀胱移行細(xì)胞RNA量之間的對應(yīng)關(guān)系。

2、 方法：(1)設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)Ⅰ確定改進(jìn)的LCM技術(shù)路線的可靠性；設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)Ⅱ，檢測shootings與RNA量之間的對應(yīng)關(guān)系；應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)，獲得均一的研究目的細(xì)胞；(2)應(yīng)用RNeasyMiniKit、theRNase-freeDnaseSet、RneasyMinEluteCleanupKit，提取、純化及濃縮微量TotalRNA；(3)應(yīng)用RNA體外線性擴(kuò)增技術(shù)獲得高質(zhì)量、充足的aRNA；(4)應(yīng)用RT-

3、PCR技術(shù)鑒定β-actin基因在擴(kuò)增前、后RNA中表達(dá)水平。 結(jié)果：(1)對照實(shí)驗(yàn)Ⅰ顯示采用改進(jìn)的LCM技術(shù)獲得的RNA完整性好；(2)對照實(shí)驗(yàn)Ⅱ顯示捕獲膀胱移行細(xì)胞4萬shootings可獲得RNA484ng；(3)獲得均質(zhì)性膀胱移行細(xì)胞及癌細(xì)胞TotalRNA(ng級)；(4)獲得片段大小為0.5～2.5kb的aRNA(ug級)；(5)β-actin基因在擴(kuò)增前、后RNA中恒定表達(dá)。 結(jié)論：LCM結(jié)合RNA線性擴(kuò)增

4、技術(shù)獲取均一的、完整性好的、足量的目的細(xì)胞RNA，可用于進(jìn)一步膀胱癌相關(guān)基因研究。 第二部分：膀胱移行細(xì)胞癌與膀胱移行細(xì)胞基因差異表達(dá)研究 目的：(1)優(yōu)化DDRT-PCR反應(yīng)條件，確定適合微量RNA的最佳條件；(2)篩選膀胱癌與膀胱正常移行細(xì)胞間的差異表達(dá)基因，并從基因水平確定差異表達(dá)基因?yàn)榘螂装┫嚓P(guān)基因。 方法：(1)應(yīng)用熒光mRNA差異顯示技術(shù)(DDRTPCR)篩選差異表達(dá)基因；(2)差異表達(dá)基因條帶克隆、

5、測序；(3)序列Genebank同源性檢索；(4)ReverseNorthernBlot雜交驗(yàn)證差異條帶真實(shí)性；(5)Quantitativereal-timePCR進(jìn)一步驗(yàn)證基因表達(dá)差異真實(shí)性，并檢測差異基因相對表達(dá)強(qiáng)度；(6)從基因水平確定差異表達(dá)基因是否為膀胱癌相關(guān)或新相關(guān)基因。 結(jié)果：(1)對27條差異表達(dá)基因片段命名為BCRG1-27；(2)Genebank檢索結(jié)果：部分與已知基因同源；部分與未知功能基因同源；部分與人

6、類染色體克隆序列同源；(3)基因表達(dá)差異經(jīng)ReverseNorthernBlot、Quantitativereal-timePCR驗(yàn)證，與DDRT-PCR結(jié)果一致； 結(jié)論：從基因水平確定：(1)首次從基因水平確定HMGB1為膀胱癌相關(guān)基因；(2)首次從基因水平確定TopBP1，ANGPTL3，AGA，SCAR1，MON2homolog，SETX，bromodomainPHDfingertranscriptionfactor為腫瘤

7、及膀胱癌新的相關(guān)基因；(3)首次從基因水平確定BCRG5、7、8、10、11、12、14、16、19、26為新功能基因，且與腫瘤及膀胱癌相關(guān)；(4)首次從基因水平推斷BCRG2、3、4、13、18、20、23、24可能是新的腫瘤及膀胱癌相關(guān)基因。 第三部分：Cu、Zn-SODTopBP1HMGB1蛋白在膀胱癌表達(dá)水平研究 目的：一方面明確Cu、Zn-SOD、TopBP1、HMGB1基因相應(yīng)蛋白在膀胱癌與正常膀胱移行細(xì)胞間

8、是否存在相應(yīng)的表達(dá)水平差異，進(jìn)而從蛋白水平確定此三種基因?yàn)槟[瘤及/或膀胱癌相關(guān)基因；另一方面，明確此三種蛋白與膀胱移行細(xì)胞癌分級、浸潤程度的相關(guān)性，從而確定差異基因所表達(dá)蛋白與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展的可能相關(guān)性。 方法：應(yīng)用組織芯片免疫組化技術(shù)，檢測Cu、Zn-SOD、TopBP1、HMGB1在膀胱移行細(xì)胞(30例)、膀胱移行細(xì)胞癌Ⅰ級(30例)、膀胱移行細(xì)胞癌Ⅱ級(30例)、膀胱移行細(xì)胞癌Ⅲ級(30例)中的表達(dá)，并分析其表達(dá)水平與

9、癌細(xì)胞分級、浸潤深度的相關(guān)性。 結(jié)果：(1)Cu、Zn-SOD蛋白表達(dá)水平膀胱癌高于膀胱移行細(xì)胞；表達(dá)水平與癌細(xì)胞分級負(fù)相關(guān)；表達(dá)水平與癌浸潤深度正相關(guān)；(2)TopBP1蛋白表達(dá)水平膀胱癌低于膀胱移行細(xì)胞；與在基因水平上確定的表達(dá)差異相一致。與膀胱癌分級、浸潤深度無關(guān)；(3)HMGB1蛋白膀胱癌高于膀胱移行細(xì)胞，與在基因水平上確定的表達(dá)差異相一致；表達(dá)水平與癌細(xì)胞分級負(fù)相關(guān)；表達(dá)水平與癌浸潤深度正相關(guān)。 結(jié)論：(1)從