FGF21對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 1.檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)患者血清中成纖維生長(zhǎng)因子21(FGF21)表達(dá)水平,探討AS對(duì)FGF21表達(dá)水平的影響。
　　 2.采用致AS因子處理血管內(nèi)皮細(xì)胞,檢測(cè)FGF21表達(dá)水平變化,探討體外實(shí)驗(yàn)中致AS因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞FGF21表達(dá)水平的影響。
　　 3.研究血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在FGF21刺激下,動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子對(duì)氧磷酶1(PON1),肝細(xì)胞核因子(Foxa2)表達(dá)量的變化。

2、　　 4.研究FGF21對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,從而探討FGF21對(duì)AS的作用。
　　 方法：
　　 1.檢測(cè)AS患者血清中FGF21水平收集動(dòng)脈粥樣硬化患者和正常健康人血清標(biāo)本,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)檢測(cè)患者和正常健康人血清中FGF21水平,并比較兩者水平差異。
　　 2.通過(guò)細(xì)胞白介素-6(IL-6)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作用血管內(nèi)皮細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞FGF21水平變化。

3、
　　 1)血管內(nèi)皮細(xì)胞分成三組:IL-6處理組；ox-LDL處理組；IL-6+oxLDL處理組。每組中空白對(duì)照組為只加DMEM完全培養(yǎng)基組。
　　 2)各組處理因素分別作用細(xì)胞12h,24h,48h后,酚.氯仿法提取細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)成cDNA,擴(kuò)增后,加入FGF21引物進(jìn)行real-time PCR。
　　 3)分析比較各組FGF21 mRNA水平差異
　　 3.檢測(cè)FGF21對(duì)PON1,Foxa2表達(dá)

4、量的影響
　　 1)血管內(nèi)皮細(xì)胞用不同作用時(shí)間FGF21(50ng/ml)處理:12h,24h,48h。對(duì)照組細(xì)胞只加DMEM完全培養(yǎng)基。
　　 2)收集細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后加入PON1引物,Foxa2引物進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)PON1 mRNA表達(dá)水平。
　　 3)血管內(nèi)皮細(xì)胞用不同濃度FGF21處理:0,6.25ng/ml,12.Sng/ml,25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml。對(duì)照

5、組細(xì)胞只加DMEM完全培養(yǎng)基。
　　 4)作用24h后,收集細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄后加入PON1引物和Foxa2引物進(jìn)行real-time PCR,檢測(cè)PON1 mRNA表達(dá)水平。
　　 5)血管內(nèi)皮細(xì)胞用不同濃度FGF21處理:0,6.25ng/ml,50ng/ml。RIPA(含1％PMSF)裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后,采用western blot檢測(cè)蛋白水平。
　　 6)巨噬細(xì)胞用不同濃度FG

6、F21處理:0,6.25ng/ml,50ng/ml。RIPA(含1％PMSF)裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后,采用western blot檢測(cè)蛋白水平。
　　 4.FGF21對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
　　 1)紫杉醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡敏感性比較。血管內(nèi)皮細(xì)胞用不同濃度紫杉醇出處理:0,10-7mol/L,0.5x10-6 mol/L,10-5mol/L,10-4 mol/L。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀

7、檢測(cè)吸光度,篩選出紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳濃度。
　　 2)篩選出合適紫杉醇濃度后,將血管內(nèi)皮細(xì)胞分成三組:紫杉醇處理組；6.25ng/ml FGF21+紫杉醇處理組；50ng/ml FGF21+紫杉醇處理組。對(duì)照組為加DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)組。每組三個(gè)樣本。
　　 3)提取細(xì)胞蛋白,通過(guò)caspase3試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞caspase3活性。觀察FGF21對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,及不同濃度FGF21對(duì)細(xì)胞凋亡保

8、護(hù)程度差別。
　　 4)提取細(xì)胞蛋白,easpase8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞easpase8活性。觀察FGF21對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,及不同濃度FGF21對(duì)細(xì)胞凋亡保護(hù)程度差別。
　　 結(jié)果：
　　 1.與正常健康組相比,AS患者血清內(nèi)FGF21水平明顯升高。
　　 2.(1)IL-6處理組中,FGF21 mRNA表達(dá)量具有時(shí)間依賴性。mRNA水平在12h時(shí)高于對(duì)照組,而在48h時(shí)表達(dá)量顯著升高,(

9、P<0.01),是對(duì)照組的36倍。
　　 (2)ox-LDL處理組中,細(xì)胞經(jīng)ox-LDL作用不同時(shí)間段后,與對(duì)照組相比,FGF21 mRNA表達(dá)量均上升,并在24h時(shí)達(dá)到最高值。
　　 (3)ox-LDL+IL-6處理組中,ox-LDL+IL-6處理后FGF21 mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組,其中處理時(shí)間為24h時(shí),mRNA表達(dá)量最高,是對(duì)照組的144倍。
　　 3.(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞用50ng/ml FGF21處

10、理不同時(shí)間后,PON1和Foxa2 mRNA表達(dá)量變化呈時(shí)間依賴性。
　　 (2)血管內(nèi)皮細(xì)胞用不同濃度FGF21處理24h后,PON1和Foxa2 mRNA表達(dá)量變化呈劑量依賴性。
　　 (3)血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)兩種濃度FGF21(6.25ng/ml,50ng/ml)處理后,PON1蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組,且在50ng/ml濃度時(shí)蛋白表達(dá)量高于6.25ng/ml時(shí)。
　　 (4)巨噬細(xì)胞經(jīng)兩種濃度FGF21(6.2

11、5ng/ml,50ng/ml)處理后,HUVECs組PON1蛋白表達(dá)量6.25ng/ml濃度時(shí)蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組。
　　 4.(1)細(xì)胞經(jīng)紫杉醇(5×10-6mol/L)處理后,caspase-3和caspase-8活性明顯高于對(duì)照組,說(shuō)明已成功建立細(xì)胞凋亡模型。
　　 (2)FGF21處理細(xì)胞后,caspase-3和caspase-8活性均低于只加紫杉醇處理組,且隨著加入的FGF21濃度升高,活性進(jìn)一步降低。

12、　　 結(jié)論：
　　 1.AS狀態(tài)下,FGF21水平升高,并且隨著疾病的發(fā)展FGF21水平也升高。推測(cè)可能是機(jī)體對(duì)疾病的代償性功能。所以,FGF21可能對(duì)AS有調(diào)節(jié)作用。
　　 2.FGF21能上調(diào)抗動(dòng)脈粥樣硬化因子PON1,Foxa2表達(dá)量。
　　 3.FGF21能保護(hù)在AS發(fā)展過(guò)程中起重要作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　 4.FGF21對(duì)AS的影響可能與內(nèi)皮細(xì)胞PON1,Foxa2,凋亡因子等的表達(dá)有關(guān)