組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖與分化的調(diào)控研究.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童常見(jiàn)的顱外實(shí)體腫瘤之一，約占兒童腫瘤的6-10％，年發(fā)病率大約為1/10萬(wàn)，僅低于白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占兒童癌癥死亡的15%。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，主要起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)嵴祖細(xì)胞，其最常見(jiàn)的發(fā)生部位是腎上腺，也可以發(fā)生于頸部、胸部、腹部等的神經(jīng)組織。神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床表現(xiàn)為惡性程度高、異質(zhì)性高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)以及預(yù)后差等特點(diǎn)，因此神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療比較困難，除少數(shù)可自行退化緩解或早期可完全切除

2、以外，其余病例預(yù)后較差，即使經(jīng)過(guò)多種手段聯(lián)合治療其長(zhǎng)期生存率仍然小于40%。因此，研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)理，探索影響該腫瘤細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并闡釋這些靶點(diǎn)對(duì)其增殖與分化的作用機(jī)理，可以為臨床治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供新策略和新方法。
　　表觀遺傳調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示組蛋白甲基化對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)增殖有著十分重要的影響。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶通過(guò)參與組蛋白甲基化，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)演進(jìn)起著重要的作用，因此研究組蛋

3、白甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能及作用機(jī)制，有重要的理論及臨床價(jià)值。SETDB1是一種組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，主要參與H3K9me3的甲基化，現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示SETDB1參與小鼠的胚胎發(fā)育，特別是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有十分重要的影響，對(duì)腫瘤的增殖和生長(zhǎng)也具有重要影響。但在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶 SETDB1及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用現(xiàn)有的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床數(shù)據(jù)庫(kù)中患者的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，分析 SETDB1與神經(jīng)母

4、細(xì)胞瘤預(yù)后之間的關(guān)系。通過(guò)構(gòu)建上調(diào)和下調(diào) SETDB1的慢病毒質(zhì)粒對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)行轉(zhuǎn)染，檢測(cè)上調(diào)或下調(diào)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中SETDB1的表達(dá)水平，研究SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖分化調(diào)控作用的分子機(jī)制，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床治療新策略提供理論依據(jù)。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下：
　?、俳M蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶 SETDB1與神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后的關(guān)系分析
　　利用神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床在線數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶 SETDB1在神

5、經(jīng)母細(xì)胞瘤患者基因組表達(dá)譜中的表達(dá)情況，分析 SETDB1的表達(dá)量與神經(jīng)母細(xì)胞瘤預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，SETDB1的表達(dá)量與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后呈顯著相關(guān)，SETDB1表達(dá)量越高，患者的總體存活率越低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差；反之，SETDB1表達(dá)量低，患者總體存活率高，預(yù)后較好。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療效果與診斷時(shí)患兒的年齡及臨床分期有關(guān)，患兒年齡越大，分期越后，腫瘤越容易擴(kuò)散，則預(yù)后越差，而患兒診斷年齡18個(gè)月被定義為決定風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵年齡節(jié)點(diǎn)。

6、通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，SETDB1隨著神經(jīng)母細(xì)胞瘤分期的進(jìn)展，SETDB1表達(dá)也有差異，其中在IV（st4）期患者中 SETDB1的表達(dá)量顯著升高。在患兒診斷年齡≤18個(gè)月時(shí)，SETDB1的表達(dá)量低，在患兒診斷年齡>18個(gè)月時(shí)，SETDB1的表達(dá)量顯著增高。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)在因腫瘤致死的患者中，SETDB1的表達(dá)量顯著高于未死亡患者。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn) SETDB1的表達(dá)量與神經(jīng)母細(xì)胞瘤原癌基因 N-MYC的擴(kuò)增呈正相關(guān)，N-MYC的擴(kuò)增與神經(jīng)母細(xì)胞

7、瘤的發(fā)生及復(fù)發(fā)有緊密聯(lián)系，由于神經(jīng)母細(xì)胞瘤起源于胚胎發(fā)育過(guò)程中的神經(jīng)嵴細(xì)胞，因此我們推測(cè) SETDB1可能參與調(diào)控原癌基因或抑癌基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，使交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生紊亂，從而促使神經(jīng)母細(xì)胞瘤的形成?；谝陨戏治?，我們推測(cè) SETDB1可以作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者風(fēng)險(xiǎn)分層中的重要參考指標(biāo)。
　?、诮M蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響
　　為了研究 SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤

8、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響及其分子機(jī)制，本研究通過(guò)構(gòu)建上調(diào)及下調(diào) SETDB1的慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤感染SETDB1si慢病毒，研究下調(diào) SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的影響。結(jié)果表明，SETDB1si干涉后，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。利用 CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示SETDB1si干涉后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖基本完全被抑制。同時(shí)采用 BrdU、Ki67等增殖標(biāo)記對(duì)神經(jīng)母

9、細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) SETDB1si干涉后BrdU陽(yáng)性率及 Ki67陽(yáng)性率都顯著降低。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果表明下調(diào) SETDB1引起細(xì)胞周期阻滯在 G1期。通過(guò) Western blotting檢測(cè)Cyclin和CDK的表達(dá)顯示，SETDB1si干涉后，G1期特異性Cyclin和CDK2的蛋白表達(dá)水平明顯降低，暗示著SETDB1可能調(diào)控G1期特異性Cyclin和CDK2的表達(dá)，促使細(xì)胞周期阻滯在G1期

10、，從而抑制細(xì)胞增殖。通過(guò)軟瓊脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào) SETDB1降低了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的克隆形成能力，利用免疫缺陷鼠構(gòu)建SETDB1si的小鼠移植模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SETDB1si后的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不能在免疫缺陷鼠中長(zhǎng)出腫瘤。為了進(jìn)一步探索 SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖，我們對(duì)下調(diào)SETDB1后的細(xì)胞進(jìn)行恢復(fù)SETDB1的表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恢復(fù)SETDB1的表達(dá)后，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖和生長(zhǎng)、克隆形成能力及在免疫缺陷鼠體內(nèi)的成瘤能力都得到了恢復(fù)

11、。這些結(jié)果表明，下調(diào) SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖具有明顯的抑制作用。
　?、劢M蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤嘌呤核苷酸合成的影響
　　為了探討下調(diào) SETDB1引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖抑制的分子機(jī)制，本研究對(duì)SETDB1si干涉后的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜分析，與對(duì)照GFPsi相比，發(fā)現(xiàn)下調(diào)SETDB1影響嘌呤代謝相關(guān)途徑。進(jìn)一步的分析研究發(fā)現(xiàn)，SETDB1si干涉后嘌呤從頭合成途徑的關(guān)鍵酶基因顯著下

12、調(diào)。通過(guò) CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在SETDB1si后的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中補(bǔ)償20μM的IMP，AMP，GMP之后，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)得到部分恢復(fù)。嘌呤從頭合成途徑關(guān)鍵酶PRPS1作用是將5-磷酸-核糖催化生成5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP），而PRPP是嘌呤從頭合成途徑中的第一個(gè)中間產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)PRPS1進(jìn)行干涉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)PRPS1也出現(xiàn)了類似下調(diào)SETDB1的效果，如細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞的克隆能力減弱等。這些結(jié)果暗示下調(diào)SETD

13、B1引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖受到抑制與SETDB1si干涉后抑制了嘌呤核苷酸合成有關(guān)。
　　④組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化影響的初步研究
　　有報(bào)道顯示腫瘤中存在一小群細(xì)胞，其能夠引發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展并維持腫瘤的“干性”特征，稱為腫瘤干細(xì)胞，其具有無(wú)限復(fù)制、自我更新能力以及分化潛能。臨床研究表明在低齡兒童的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中，有少部分病人可以自發(fā)轉(zhuǎn)化成良性腫瘤，或者自行消退，即在極少甚至無(wú)系統(tǒng)治療的

14、情況下腫瘤縮小甚至消失的現(xiàn)象。有研究報(bào)道神經(jīng)母細(xì)胞瘤 BE(2)-C細(xì)胞可以通過(guò)維甲酸誘導(dǎo)向神經(jīng)元方向分化，表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物，如NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2、DBH等，也可以在BrdU的誘導(dǎo)下向膠質(zhì)細(xì)胞分化，表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記（GFAP、Vimentin、ALDH1L1等）。Bmi-1、MYCN、Nestin等基因在維持神經(jīng)母細(xì)胞瘤的“干性”中扮演著十分重要的作用。在研究SETDB1的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)SETDB1并

15、沒(méi)顯著的增加神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖能力，但是軟瓊脂實(shí)驗(yàn)顯示明顯增加了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的自我更新能力。這說(shuō)明上調(diào)SETDB1增加了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的自我更新能力。對(duì)細(xì)胞形態(tài)的的觀察發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SETDB1引起細(xì)胞表型顯著變化，出現(xiàn)分化表型。通過(guò)對(duì)表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)SETDB1引起了維持神經(jīng)母細(xì)胞瘤“干性”基因和神經(jīng)元標(biāo)記基因的表達(dá)量下降，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)量升高。進(jìn)一步的通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)SETDB1引起了神經(jīng)母細(xì)

16、胞瘤的“干性”維持基因MYCN、Bmi-1的表達(dá)量顯著下降，神經(jīng)元標(biāo)記如NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2及DBH等表達(dá)量顯著降低，但是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP、Vimentin、ALDH1L1等表達(dá)量明顯升高。而恢復(fù)SETDB1的表達(dá)，MYCN、Bmi-1的表達(dá)得到顯著提高，神經(jīng)元標(biāo)記基因NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2及DBH等也顯著恢復(fù)，但是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP、Vimentin、ALDH1L1顯

17、著降低。這些結(jié)果暗示下調(diào)SETDB1會(huì)促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SETDB1si干涉后引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)、增殖受到抑制，下調(diào)SETDB1抑制嘌呤核苷酸的從頭合成。 SETDB1與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的“干性”維持密切相關(guān)，下調(diào) SETDB1使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)增加。SETDB1對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞的增殖和分化具有重要的作用，這對(duì)于進(jìn)一步了解神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制，探索神經(jīng)母細(xì)胞瘤新的治療靶點(diǎn)提供了一定理論