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文檔簡(jiǎn)介
1、豬克隆技術(shù)又稱體細(xì)胞核移植,其在豬的繁殖、育種和遺傳資源保護(hù)、人類醫(yī)學(xué)、藥學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域都有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。但克隆效率過(guò)低,約為1%(出生的克隆豬頭數(shù)/移植的克隆胚胎數(shù))嚴(yán)重制約了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用。引起克隆效率低下的重要原因之一是克隆胚胎重編程異常,因此,對(duì)胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控能改善豬克隆胚胎發(fā)育效率。
本研究旨在通過(guò)向豬供體細(xì)胞轉(zhuǎn)染抗SUV39H1/2(負(fù)責(zé)建立H3K9me3的組蛋白甲基化酶)的小干擾RN
2、A,或向豬克隆胚胎顯微注射KDM4A/B/KDM4D(可以特異擦除H3K9me3的組蛋白去甲基化酶)的mRNA來(lái)擦除豬克隆胚胎的H3K9me3,研究這2種方法對(duì)豬克隆胚胎在體外發(fā)育至囊胚過(guò)程中的發(fā)育效率的影響。
本研究構(gòu)建了人源KDM4A-pcDNA3.1(+)、鼠源 KDM4B-pcDNA3.1(+)和KDM4D-pcDNA3.1(+)三個(gè)表達(dá)載體,并在體外轉(zhuǎn)錄獲得了這三個(gè)基因的mRNA。然后向1細(xì)胞期豬克隆胚胎胞漿中顯微注
3、射KDM4A/B/D mRNA。同時(shí),設(shè)計(jì)合成并篩選了SUV39H1/H2最優(yōu)的干擾RNA(siRNA),在豬克隆胚胎供體細(xì)胞中連續(xù)兩次共轉(zhuǎn)染SUV39H1/H2 siRNA。分別統(tǒng)計(jì)觀察兩種方法獲得的克隆胚胎體外發(fā)育至囊胚的效率,并于體外培養(yǎng)24h收集部分胚胎通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H3K9me3表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
?。?)在克隆胚胎中顯微注射KDM4A/B/D基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在一定程度上可以提高胚胎體外發(fā)育的囊胚率,但統(tǒng)
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