甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對神經(jīng)母細胞瘤細胞生長與增殖的調(diào)控研究.pdf

1、昆蟲干細胞生物學是昆蟲學研究領(lǐng)域的前沿熱點難點之一，但截至目前除果蠅外，昆蟲干細胞的研究開展尚不充分。家蠶作為鱗翅目昆蟲的典型代表，其一生經(jīng)歷多次新舊組織的交替和結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化，開展家蠶干細胞研究，特別是研究家蠶發(fā)育、變態(tài)過程中干細胞調(diào)控的作用機制，將為闡明昆蟲發(fā)育的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)，也為鱗翅目害蟲的防治新策略提供理論依據(jù)。相對于果蠅及哺乳動物較為完善的干細胞研究系統(tǒng)，家蠶干細胞研究技術(shù)體系的建立迫在眉睫。針對目前缺少家蠶干細胞特異性分

2、子標記這一關(guān)鍵技術(shù)難題，選取起源于胚胎發(fā)育時期具有分化潛力的神經(jīng)母細胞瘤細胞作為替代研究對象，尋找調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖與分化的關(guān)鍵酶基因，闡明靶點基因?qū)ζ浼毎鲋撑c分化的作用機理，探索該腫瘤的發(fā)生機理，借鑒其研究結(jié)果，將為開展家蠶干細胞的鑒定、維持及分化的調(diào)控研究提供理論參考。
　　神經(jīng)母細胞瘤是一種兒童最常見的顱外實體腫瘤，主要起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)嵴祖細胞，其臨床表現(xiàn)具有高異質(zhì)性、惡性程度高、預后差、易轉(zhuǎn)移和易復發(fā)等特

3、點。腫瘤細胞生長的表觀遺傳調(diào)控是當前腫瘤生物學研究的熱點之一，諸多實驗證據(jù)證實組蛋白甲基化對腫瘤的生長增殖有著十分重要的影響。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶通過參與組蛋白甲基化，對腫瘤的生長發(fā)育起著重要的作用，研究組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能及作用機制，有重要的理論及臨床價值?；诮M蛋白甲基化的調(diào)控紊亂可能在多種人類疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，本研究以組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a及5種神經(jīng)母細胞瘤細胞作為研究對象，利用神經(jīng)母細胞瘤在線臨床數(shù)據(jù)庫中患者基因組

4、表達數(shù)據(jù)進行分析，探討G9a與神經(jīng)母細胞瘤患者預后之間的關(guān)系。利用G9asi質(zhì)粒通過慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)對神經(jīng)母細胞瘤細胞進行轉(zhuǎn)染，并同時使用G9a特異性抑制劑處理細胞，檢測G9a受到抑制時對神經(jīng)母細胞瘤細胞生長與增殖的影響，探討G9a在神經(jīng)母細胞瘤細胞中對組蛋白甲基化的形式的影響及其對細胞生長增殖調(diào)控作用的分子機制，為神經(jīng)母細胞瘤的臨床治療新策略提供理論依據(jù)及新思路，為家蠶干細胞的維持及分化調(diào)控提供理論支持。
　　本研究獲得的主要研究

5、結(jié)果如下:
　　1.組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a與神經(jīng)母細胞瘤預后的關(guān)系分析
　　利用兩個獨立的神經(jīng)母細胞瘤臨床在線數(shù)據(jù)庫，檢索組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在神經(jīng)母細胞瘤患者基因組表達譜巾的表達情況，分析并預測G9a的表達量與神經(jīng)母細胞瘤患者預后的關(guān)系。結(jié)果表明，G9a的表達量與神經(jīng)母細胞瘤患者的預后結(jié)果密切相關(guān)，G9a表達量高，患者整體存活率低，預后差;G9a表達量低，患者整體存活率高，預后好。并且，G9a在不同臨床分期的神經(jīng)母細

6、胞瘤患者體內(nèi)表達情況有差異，其中在Ⅳ期患者中G9a的表達量突然顯著升高，而在Ⅳ-s期患者中其表達量又明顯下降。在患兒診斷年齡≤18個月時，G9a的表達量低，在患兒診斷年齡＞18個月時，G9a的表達量高。神經(jīng)母細胞瘤的治療效果與診斷時患兒的年齡及臨床分期有關(guān)，患兒年齡越大，分期越后，腫瘤越容易擴散，則預后越差，而患兒診斷年齡18個月被定義為決定風險的關(guān)鍵年齡節(jié)點?；谏窠?jīng)母細胞瘤的這些特點，我們推測G9a可能成為神經(jīng)母細胞瘤患者風險分層中

7、的重要參考指標，并作為神經(jīng)母細胞瘤預后的一個重要標記。同時我們發(fā)現(xiàn)G9a的表達量與神經(jīng)母細胞瘤原癌基因N-MYC的擴增密切相關(guān)，由于神經(jīng)母細胞瘤起源于胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)嵴細胞，并且N-MYC的擴增與神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生及復發(fā)緊密聯(lián)系，推測G9a可能參與調(diào)控原癌基因或抑癌基因在胚胎發(fā)育過程中的表達機制，使交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生紊亂，促使神經(jīng)母細胞瘤的形成。
　　2.抑制組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對神經(jīng)母細胞瘤細胞生長增

8、殖的影響及機制研究
　　為了鑒定G9a基因?qū)ι窠?jīng)母細胞瘤細胞生長增殖的影響及其分子機制，本研究利用G9a特異性抑制劑BIX01294(BIX)處理神經(jīng)母細胞瘤細胞引起G9a抑制，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)利用G9asi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞干涉其G9a的表達，進行細胞增殖檢測和細胞周期檢測。研究結(jié)果表明，G9a受BIX抑制或G9asi干涉后，神經(jīng)母細胞瘤細胞的生長受到抑制，細胞數(shù)量明顯減少。利用CCK8試劑盒檢測細胞的增殖情況，結(jié)果顯

9、示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖基本上被完全抑制。同時利用BrdU、Ki67等增殖標記的抗體對處于增殖周期的神經(jīng)母細胞瘤細胞進行免疫熒光標記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后BrdU陽性率及Ki67陽性率都顯著降低，證實細胞增殖受到明顯抑制。進一步利用流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果表明G9a受BIX抑制后G1期顯著增加，S期減少，說明細胞周期阻滯在G1期。通過Western blotting檢測C

10、yclin和CDK的表達顯示，G9a受BIX抑制或受G9asi干涉后，多個G1期特異性Cyclin和CDK的蛋白水平明顯降低，推測G9a可能調(diào)控G1期特異性Cyclin和CDK的表達，促使細胞周期阻滯在G1期，不能順利進入S期，從而抑制細胞增殖。
　　3.抑制組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a引起神經(jīng)母細胞瘤細胞自噬及其機制研究
　　本研究發(fā)現(xiàn)G9a受到抑制后神經(jīng)母細胞瘤細胞生長增殖受到抑制作用，為了探討G9a受到抑制引起神經(jīng)

11、母細胞瘤生長增殖受到抑制的作用機制，本研究利用G9a特異性抑制劑BIX處理神經(jīng)母細胞瘤細胞引起G9a抑制，并通過慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)利用G9asi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細胞瘤細胞干涉其G9a的表達，利用臺酚藍對BIX處理后的神經(jīng)母細胞瘤細胞進行染色發(fā)現(xiàn)，G9a受抑制后死亡細胞的數(shù)量增加，并且通過顯微鏡觀察細胞核周圍出現(xiàn)點狀物質(zhì)的聚集并產(chǎn)生空泡結(jié)構(gòu)，推測G9a受到抑制導致細胞發(fā)生自噬從而抑制細胞生長增殖。微管相關(guān)蛋白LC3B能夠標記自噬體的形成，本研究

12、進一步利用LC3B抗體對細胞進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉都促使LC3B大量表達，證實細胞自噬的發(fā)生。通過Western blotting檢測多個自噬相關(guān)基因ATG的蛋白表達，結(jié)果顯示G9a受BIX抑制或受G9asi干涉促進ATG表達升高及LC3B表達增強，同時通過Westernblotting檢測到BIX處理后神經(jīng)母細胞瘤細胞G9a蛋白表達沒有明顯降低，但H3K9me2水平顯著下降，說明抑制劑BIX不影

13、響G9a的表達，但顯著抑制G9a的功能，并且G9asi干涉后H3K9me2也顯著降低，推測G9a功能失活導致H3K9me2的水平受到抑制，促使LC3B和ATGs的轉(zhuǎn)錄增加，從而促進細胞自噬的發(fā)生。
　　4.抑制組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對神經(jīng)母細胞瘤細胞自我更新能力及致瘤性的影響研究
　　神經(jīng)母細胞瘤作為一種兒童常見的交感神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，因為其高異質(zhì)性，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復發(fā)，因此其治療十分困難。惡性腫瘤易轉(zhuǎn)移、易復發(fā)是

14、因為在腫瘤細胞中存在一小群細胞，稱為腫瘤干細胞，其能夠引發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展并維持腫瘤的特性，并且其具有無限復制和自我更新能力。為了進一步闡明G9a對神經(jīng)母細胞瘤細胞生長發(fā)育的影響，本研究利用軟瓊脂克隆形成實驗及神經(jīng)母細胞瘤小鼠模型的建立，檢測抑制G9a對神經(jīng)母細胞瘤細胞自我更新能力及致瘤性的影響。將神經(jīng)母細胞瘤細胞稀釋成單細胞種入軟瓊脂進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BIX處理后的細胞或G9asi干涉后的細胞幾乎不能在軟瓊脂上形成克隆，而對照組細胞能夠形成