大豆GmSARK基因的結(jié)構(gòu)與功能分析及擬南芥兩個(gè)衰老相關(guān)突變體的初步鑒定.pdf

1、植物類受體蛋白激酶(receptor-like protein kinases，RLKs)是一類包含胞外域，單次跨膜域和胞內(nèi)激酶域的蛋白分子，它們可以通過(guò)胞外域與胞外信號(hào)分子的特異結(jié)合來(lái)激活胞內(nèi)激酶域的自磷酸化和磷酸化活性，完成跨膜傳遞信號(hào)的功能。在植物中鑒定的類受體激酶絕大多數(shù)屬于LRR型，此類型的激酶胞外域包含多個(gè)LRR基序。研究表明，胞外域的重要功能是與配基結(jié)合，其中LRR及其島狀結(jié)構(gòu)域扮演著重要的角色；胞內(nèi)的激酶域磷酸化后能夠激

2、活類受體激酶并進(jìn)一步提高酶的活性，而非激酶域的磷酸化對(duì)下游底物的識(shí)別和磷酸化起著重要的作用。目前已克隆的LRR—RLK具有參與抗逆性反應(yīng)、調(diào)節(jié)植物發(fā)育和介導(dǎo)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)功能。 衰老是自然界中普遍的生物現(xiàn)象。葉片衰老是高等植物葉片發(fā)育的最后一個(gè)階段，是一個(gè)主動(dòng)的，受遺傳程序控制的程序性死亡過(guò)程。葉衰老的起始和進(jìn)程由外部和內(nèi)部的各種因子控制，諸如葉齡、植物激素、溫度、干旱、營(yíng)養(yǎng)匱乏、黑暗和病原體的侵染等都能夠誘導(dǎo)衰老。被

3、衰老信號(hào)分子誘導(dǎo)后衰老相關(guān)基因(senescence-associated gene，SAG)上調(diào)表達(dá)，葉片衰老的程序被啟動(dòng)，發(fā)生一系列細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)事件。細(xì)胞經(jīng)歷了從合成代謝到分解代謝的轉(zhuǎn)變，如葉綠素降解、葉綠體崩潰、蛋白質(zhì)和核酸等大分子降解等，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，結(jié)構(gòu)瓦解最終細(xì)胞死亡。 光合色素的代謝和葉綠體的發(fā)育對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育乃至衰老有著重要的意義。葉綠素的代謝可分為三個(gè)階段：從谷氨酸鹽到葉綠素a合成；葉綠素a和葉綠

4、素b的相互作用；葉綠素a的降解。此外，質(zhì)體的非甲羥戊酸(nonmevalonate nonMVA)途徑也是光合色素的重要代謝途徑：在非MVA途徑中產(chǎn)生的DMAPP可以生成GGPP(geranylgeranyl diphosphate)。GGPP又是光合色素葉綠素和類胡蘿卜素的前體。葉綠素代謝途徑和非MVA．途徑中關(guān)鍵酶的基因突變，都可以導(dǎo)致代謝途徑受阻，產(chǎn)生葉色白化表型的突變體。葉綠體的發(fā)育受諸多生理生化事件影響，其中類囊體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)系

5、統(tǒng)對(duì)葉綠體的發(fā)育至關(guān)重要，類囊體蛋白定位途徑中的關(guān)鍵酶基因突變導(dǎo)致植物葉色白化、葉綠體的發(fā)育受抑制。 本實(shí)驗(yàn)室的前期研究從人工誘導(dǎo)的大豆初生葉片的衰老體系中克隆到一個(gè)新的LRR型植物類受體蛋白激酶基因GmSARK(GenBank Accession No． AY687391)。GmSARK基因在衰老的葉片中上調(diào)表達(dá)，GmSA．RK基因被敲除的轉(zhuǎn)基因大豆與野生型對(duì)照比可以延緩衰老，這暗示該基因可能參與大豆的葉片衰老調(diào)控。LRR型R

6、LK的胞外域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和胞內(nèi)近膜域及C末端域的磷酸化狀態(tài)對(duì)受體與配基的結(jié)合以及信號(hào)的傳遞有重要作用。基于LRR—RLK結(jié)構(gòu)對(duì)其參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能有重要的作用，我們分析了GmSARK蛋白的結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，依據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)我們?cè)O(shè)計(jì)了該基因的全長(zhǎng)、激酶域和激酶域缺失的過(guò)表達(dá)雙元載體的構(gòu)建。在擬南芥和番茄中過(guò)表達(dá)GmSARK基因，轉(zhuǎn)基因植株的葉片與野生型對(duì)照比呈現(xiàn)黃色、植株早衰、不能完成生活史；轉(zhuǎn)基因番茄葉片中葉綠素合成和降解的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)也相應(yīng)

7、的降低和增加，葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因CAB表達(dá)明顯低于野生型。過(guò)表達(dá)GmSARK基因激酶域的擬南芥植株與野生型相比其表型、生理特征及指示基因的表達(dá)水平無(wú)明顯的差異，而過(guò)表達(dá)激酶域缺失的GmSARK基因的擬南芥植株卻有明顯的早衰特點(diǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明 GmSARK基因直接參與調(diào)控葉片衰老進(jìn)程并可能是衰老信號(hào)的上游組份；其胞外域缺失不能進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，胞外域?qū)εc配基結(jié)合起重要作用；過(guò)表達(dá)缺失激酶域的GmSARK與過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株表型一致，

8、暗示胞外域和近膜域?qū)εc配基結(jié)合及將信號(hào)傳遞給互作組分起更重要的作用。此外，在擬南芥中過(guò)表達(dá)GmSARK基因時(shí)得到的株系F10在T2代可分離出真葉白色和真葉黃而透明的小苗，分別命名為．y1和y2。外源GmSARK基因不表達(dá)，說(shuō)明y1和y2為T-DNA整合位點(diǎn)所在基因功能喪失的隱性突變。這兩個(gè)突變體真葉的表面結(jié)構(gòu)和葉肉細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與野生型相比有明顯的差異，尤其是葉綠體的發(fā)育明顯受到抑制，沒(méi)有完整類囊體膜的形成。光合作用及衰老相關(guān)的指示基因

9、在突變體和野生型中的表達(dá)也存在顯著的差異。用染色體步移法尋找兩個(gè)突變體的外源T-DNA整合位點(diǎn)，結(jié)果揭示它們都在擬南芥第四條染色體上編碼推測(cè)的SecA類型葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)因子(SecA-type chloroplast protein transport factor)的基因上有外源T-DNA插入。SecA類型葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)因子是類囊體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的Sec途徑中的組分。研究Sec途徑對(duì)類囊體蛋白的定位機(jī)制可進(jìn)一步了解葉綠體發(fā)育，對(duì)研究光合