黃瓜肌動(dòng)蛋白基因及矮牽牛花特異性啟動(dòng)子的克隆和分析.pdf

1、雄性不育在植物界中是一種常見現(xiàn)象，由于雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，對(duì)雄性不育機(jī)理的探索具有重要的應(yīng)用價(jià)值。已有研究表明，植物肌動(dòng)蛋白與雄性不育有關(guān)，而黃瓜性別決定形式復(fù)雜多樣，其中全雌株只開雌花而無雄花，類似于雄性不育，因此研究黃瓜肌動(dòng)蛋白與雄性不育的關(guān)系，將有助于對(duì)雄性不育的發(fā)生機(jī)理的全面認(rèn)識(shí)。本研究分別從黃瓜和矮牽牛中克隆了肌動(dòng)蛋白基因和花特異啟動(dòng)子，并進(jìn)行了相關(guān)分析，主要結(jié)果如下。
　　1、通過1次PCR擴(kuò)增從全雌性黃瓜中

2、同時(shí)獲得了長度分別為1186bp、955bp和870bp的3個(gè)肌動(dòng)蛋白基因片段 Act1、Act2和Act3（GenBank登錄號(hào)：DQ115881、DQ115882和DQ115883）。序列分析表明，3個(gè)肌動(dòng)蛋白基因片段與GenBank中收錄的肌動(dòng)蛋白基因序列（如AF386514.1、AF059484.1和AB010922.1等）高度同源。Act1中1~580bp、984~1186bp，Act2中1~580bp、753~955bp，A

3、ct3中1~580bp、753~955bp為外顯子編碼區(qū)，其余為內(nèi)含子序列，3個(gè)基因內(nèi)含子的兩端序列均符合典型的“GT-AG”規(guī)則。RT-PCR分析表明，Act1基因僅在根中表達(dá)，Act2基因在根和雌花中表達(dá)，而Act3基因在所有檢測的器官（包括根、莖、葉、卷須、雌花和幼果）中都表達(dá)，提示黃瓜根的生長發(fā)育可能需要多種肌動(dòng)蛋白基因的參與，而Act2和Act3可能與黃瓜雌性系的形成發(fā)育有關(guān)。
　　2、通過1次PCR擴(kuò)增從矮牽牛基因組D

4、NA中同時(shí)擴(kuò)增出長為550bp和354bp的兩個(gè)花特異表達(dá)的啟動(dòng)子（分別命名為PchsA-L和PchsA-S；GenBank登錄號(hào)：EF199747和EF199748），其中PchsA-L與PchsA-S相比，除個(gè)別堿基有差異外，在第88~269bp多出一段182bp的序列，該182bp序列第103~201bp含有典型的內(nèi)含子特征。通過BLAST軟件分析，PchsA-L與GenBank中chsA基因啟動(dòng)子序列AY360358、S5298

5、4和X14591最大相似片段的相似性分別為97％（228/234）、96%（145/151）和96%（145/151）；其第103~201bp區(qū)域與矮牽牛chsD基因（GenBank登錄號(hào)X14593）相似性為94%（73/77），與GenBank登錄號(hào)AB244234、AB244229和AB244221的F3’，5’H（falvonoid3’，5’-hydroxylase）基因相似性均為94%（34/36），與GenBank登錄號(hào)AB

6、244228的F3’，5’H基因相似性為96%（27/28）。PchsA-S與 AY360358、S52984和X14591最大相似片段的相似性分別為98%（348/354）、96%（262/271）、96%（262/271）。應(yīng)用DNAStar軟件分析表明兩條序列均含有普通啟動(dòng)子的保守序列TATA box、CCAAT box、cap site（CCATAA），并含有花特異表達(dá)啟動(dòng)子的特征序列TACPyAT box、anther box

7、（TAGAAGTGACAGAAAT）、G-box（CACGTG）、box1元件（ATGTCACGTGCCATC）和box2元件（TGTGTTGAAGGTTTGCTA）。
　　對(duì)克隆啟動(dòng)子所用的矮牽牛后代群體分析顯示，130個(gè)單株中只含有PchsA-S的共有13株，含有2個(gè)啟動(dòng)子的共有97株，只含有PchsA-L的共有20株，其分離比并不符合1：2：1。對(duì)克隆啟動(dòng)子所用的矮牽牛的染色體數(shù)目分析顯示，其含有14條染色體，為二倍體。

8、r>　　3、利用質(zhì)粒pBIN19、pGFP、pCHS，分別構(gòu)建了啟動(dòng)子CaMV35S、PchsA-S和PchsA-L驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBIN-35S-GFP、pBIN-PchsA-S-GFP和pBIN-PchsA-L-GFP，并導(dǎo)入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K599。K599（分別含有3個(gè)不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體）侵染矮牽牛葉片，均獲得轉(zhuǎn)基因不定根，并從不定根再生植株。對(duì)誘導(dǎo)的不定根和再生植株基因組 DNA的PCR檢測表明，野生型發(fā)根農(nóng)桿菌K

9、599 Ri質(zhì)粒中的rolB基因和外源gfp基因均成功轉(zhuǎn)入到矮牽?；蚪M中；并且，CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因不定根和再生植株葉片在藍(lán)色光激發(fā)下都能發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，表明gfp基因?qū)崿F(xiàn)了高效表達(dá)。
　　本研究結(jié)果為探討肌動(dòng)蛋白與雄性不育之間的分子機(jī)理以及進(jìn)一步利用基因工程創(chuàng)造雄性不育提供了重要基礎(chǔ)。此外，獲得的啟動(dòng)子CaMV35S、PchsA-S和PchsA-L驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株為進(jìn)一步分析啟動(dòng)子PchsA-S和PchsA-L