陰道毛滴蟲衰老相關基因消減雜交文庫構建及Tv-Sir2-like基因功能研究.pdf

1、研究目的：(1)構建模式生物陰道毛滴蟲衰老相關基因差異表達消減雜交文庫,篩選陰道毛滴蟲細胞衰老相關基因。(2)克隆陰道毛滴蟲細胞的SIR2同源基因:Tv-SIR2-like。構建Tv-SIR2-like原核表達重組質粒及表達其重組蛋白。
　　材料和方法：建立模式生物陰道毛滴蟲的研究體系,即攝入正常熱量的正常生長細胞模型和限制熱量攝入的長壽細胞模型。在此基礎上采用抑制性消減雜交技術構建陰道毛滴蟲細胞衰老相關基因cDNA文庫并分離和篩

2、選細胞衰老相關基因。從陰道毛滴蟲cDNA表達文庫中篩選SIR2的同源基因,并對其序列保守結構域進行同源性分析。構建Tv-SIR2-like基因原核表達重組子,IPTG誘導表達目的基因融合蛋白。
　　結果：成功構建正常生長型和長壽型模式生物陰道毛滴蟲細胞差異表達基因消減雜交cDNA文庫。從正向和反向兩個消減雜交文庫中各隨機篩選出100個克隆進行酶切鑒定,分別得到250-700bp大小不等的插入片段。測序及序列同源性分析結果顯示,正向

3、和反向兩個消減雜交文庫之間沒有彼此重復的序列。從正常生長型陰道毛滴蟲細胞的消減雜交文庫中得到三個已知的基因(分別是:Fructose-1,6-bisphosphate aldolase,40Sribosomal protein及N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase),以及5個未知基因的序列,可能是新基因;從長壽型陰道毛滴蟲細胞的消減雜交文庫中也獲得三個已知的基因(分別是:Cysteine proteina

4、se,Ribulose及actin),以及5個未知基因的序列,也可能是新基因;其余序列為重復序列。從陰道毛滴蟲細胞cDNA表達文庫中成功篩選出壽命相關基因SIR2的同源基因(Tv-SIR2-like)。保守結構域序列同源性分析顯示,Tv-Sir2p-like氨基酸序列具有Sir2p及其同源蛋白質特征性的三個保守結構域。Tv-Sir2p-like可能具有Sir2p及其同源蛋白質使轉錄沉默的功能。Southern blot顯示,Tv-SIR

5、2-like在陰道毛滴蟲細胞內為單拷貝基因。Northern blot結果顯示,Tv-SIR2-like mRNA大小約1,3kb。成功構建Tv-SIR2-like原核表達重組子,IPTG誘導表達及SDS-PAGE凝膠電泳分析結果顯示,重組子在宿主菌大腸桿菌BL21內表達出預期大小的GST融合蛋白質。
　　結論：采用PCR選擇性消減雜交技術,構建了模式生物陰道毛滴蟲衰老相關基因差異表達消減雜交文庫,所篩選出的基因在陰道毛滴蟲細胞壽