陰道毛滴蟲(chóng)Tvmar1基因多態(tài)性與相關(guān)因素研究及Fd基因測(cè)序.pdf

1、背景和目的:
　　陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonas vaginalis,Tv)是一種寄生于人體泌尿生殖道的帶鞭毛的寄生原蟲(chóng)。它可以引起陰道毛滴蟲(chóng)病(trichomoniasis),還會(huì)增加如艾滋病和乙型肝炎等性傳播疾病(sexually transmitted disease,STD)感染的機(jī)會(huì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界每年陰道毛滴蟲(chóng)感染者超過(guò)1.7億。該蟲(chóng)對(duì)人體危害極大,而且流行廣泛。人型支原體(Mycoplasma hom

2、inis,Mh)也是一種寄生于人體泌尿生殖道的病原體,是已知能獨(dú)立生存的最小的微生物。它與陰道毛滴蟲(chóng)可引起類(lèi)似的并發(fā)癥:不育癥、自發(fā)性流產(chǎn)、低出生體重兒等。國(guó)外學(xué)者對(duì)于它們之間的聯(lián)系報(bào)道較早,國(guó)內(nèi)有關(guān)資料較少,本研究通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)手段,對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)進(jìn)行人型支原體檢測(cè),了解河南地區(qū)陰道毛滴蟲(chóng)與人型支原體的共生情況,并為臨床治療提供理論依據(jù)。本研究利用移動(dòng)遺傳因子(mob

3、ile genetic element,MGE)—PCR技術(shù)分析來(lái)自河南5個(gè)城市(鄭州、安陽(yáng)、洛陽(yáng)、新鄉(xiāng)、開(kāi)封)的30個(gè)陰道毛滴蟲(chóng)樣本的遺傳多態(tài)性,明確它們之間的親緣關(guān)系,并根據(jù)我們獲得的陰道毛滴蟲(chóng)的相關(guān)資料:蟲(chóng)株的地理來(lái)源、人型支原體的寄生及滴蟲(chóng)病患者的臨床癥狀和體征(分3度:輕度、中度、重度),分析這些相關(guān)因素與陰道毛滴蟲(chóng)遺傳多態(tài)性的聯(lián)系,為我省開(kāi)展陰道毛滴蟲(chóng)分子流行病學(xué)研究提供有價(jià)值的分子數(shù)據(jù)。作為最原始的真核生物,陰道毛滴蟲(chóng)缺乏

4、線粒體,其特有的雙層膜結(jié)構(gòu)氫化酶體是蟲(chóng)體的主要代謝器官。而鐵氧還蛋白(ferredoxin,Fd)作為氫化酶體代謝過(guò)程中重要的電子傳遞介體,在藥物的激活中起關(guān)鍵作用。近年來(lái),由于陰道毛滴蟲(chóng)耐藥株的產(chǎn)生,許多學(xué)者開(kāi)始關(guān)注Fd。本研究用PCR擴(kuò)增出Fd基因,選取部分陰道毛滴蟲(chóng)的Fd基因直接測(cè)序,探討陰道毛滴蟲(chóng)和人型支原體的共生以及地理來(lái)源的不同是否影響Fd基因,為臨床治療提供依據(jù)。
　　材料與方法:
　　研究所用陰道毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)株均

5、由鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院的婦產(chǎn)科或檢驗(yàn)科提供,且全部采集自女性患者。并詳細(xì)記錄每個(gè)病人的臨床資料。本研究選取30個(gè)陰道毛滴蟲(chóng)樣本,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用酚—氯仿法提取基因組DNA,并測(cè)定DNA的純度和濃度。利用MGE—PCR技術(shù),分析30個(gè)陰道毛滴蟲(chóng)樣本Tvmar1基因的長(zhǎng)度和位置的多態(tài)性,利用鄰位相連法(neighbour-joining,NJ),并借助MEGA3.1分析軟件,以Tvmar1基因的位置變化為基礎(chǔ)構(gòu)建30株陰道毛滴蟲(chóng)的聚類(lèi)樹(shù)狀圖

6、。用PCR技術(shù)對(duì)共生于陰道毛滴蟲(chóng)中人型支原體進(jìn)行鑒定和Fd基因的擴(kuò)增。選取部分陰道毛滴蟲(chóng)包括人型支原體和陰道毛滴蟲(chóng)共生的陽(yáng)性株和陰性株及來(lái)自5個(gè)不同城市的蟲(chóng)株,將它們的Fd基因送到生物公司直接測(cè)序。
　　結(jié)果
　　1.陰道毛滴蟲(chóng)體內(nèi)的人型支原體的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,30株陰道毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)株中有25株擴(kuò)增出DNA片段長(zhǎng)度為334bp的特異產(chǎn)物,可判定為陽(yáng)性,5株未能擴(kuò)出目的基因,判定為陰性。陽(yáng)性率為83.33％。
　　2.利

7、用MGE—PCR方法研究陰道毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)株間的Tvmar1基因遺傳多態(tài)性,結(jié)果顯示,陰道毛滴蟲(chóng)種間的遺傳差異明顯,遺傳距離在0到100％間均有分布(平均遺傳距離為69.11％,平均遺傳相似系數(shù)為30.89％。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的樹(shù)狀聚類(lèi)圖,發(fā)現(xiàn)有5個(gè)組的蟲(chóng)株間([Tv12、Tv29];[Tv18、Tv20];[Tv14、Tv26];[Tv10、Tv25];[Tv15、Tv21])遺傳關(guān)系最為密切,遺傳距離為0。
　　3.陰道毛滴蟲(chóng)Fd基

8、因的擴(kuò)增結(jié)果顯示,30個(gè)蟲(chóng)株均可擴(kuò)增出DNA片段長(zhǎng)度為300bp的特異產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Clustalx軟件比對(duì),發(fā)現(xiàn)10株陰道毛滴蟲(chóng)的Fd基因序列完全相同,但與GenBank中的Fd基因序列(M33717)進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)在第200位多出ctg3個(gè)堿基,多編碼1個(gè)亮氨酸,但并未導(dǎo)致讀碼框架改變?；虻耐葱詾?9％。未發(fā)現(xiàn)地理來(lái)源和有無(wú)人型支原體共生對(duì)河南地區(qū)陰道毛滴蟲(chóng)Fd基因產(chǎn)生影響。
　　結(jié)論:
　　1.河南地區(qū)陰道