超聲消融促進基因轉(zhuǎn)染治療廣泛性動脈閉塞的初步探討.pdf

1、動脈硬化閉塞癥越來越成為威脅人民健康安全的一類常見病。目前的各種治療方法可以改善部分動脈硬化閉塞癥患者的生存率及生活質(zhì)量，但是仍有一定的局限性。且仍有部分患者存在的問題在目前的治療手段下未能得到根本解決。 基因治療有可能成為人類最終征服許多難治性疾病的一種新的治療手段，已有眾多將基因治療用于動脈硬化閉塞癥的報道。然而，基因治療要廣泛地應(yīng)用于臨床尚存在許多難題，如何將目的基因安全、高效、靶向性地導(dǎo)入人體內(nèi)特定器官、組織，并在靶細(xì)胞

2、內(nèi)表達(dá)是目前有待解決的難題之一。 血管腔內(nèi)超聲消融術(shù)已經(jīng)廣泛運用于臨床，并被證實在部分動脈硬化閉塞癥中具有較好的療效。超聲及超聲聯(lián)合造影劑可促進體內(nèi)外細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)。眾多研究結(jié)果表明其在促進基因轉(zhuǎn)染的同時，對組織細(xì)胞的損傷是可逆性的，不存在明顯的毒性，具有安全、較高效率、靶向性、可控性等優(yōu)點。如果能夠?qū)⒀芮粌?nèi)超聲消融及超聲介導(dǎo)的基因治療結(jié)合起來，可能會成為一種新的治療動脈硬化閉塞癥的方法。 本實驗探討了超聲消融聯(lián)

3、合造影劑介導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human UmbilicalVein Endotheiial Cell，HUVEC)的基因轉(zhuǎn)染。 方法： 1．通過胰酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC，利用HUVEC與混雜細(xì)胞的不同生長特點對細(xì)胞進行純化，并通過CD31、FVⅢ相關(guān)抗原的免疫組化對培養(yǎng)出的細(xì)胞進行鑒定。 2．帶有編碼目的蛋白綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因片段的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌的擴增、目

4、標(biāo)質(zhì)粒的提取獲得純度及產(chǎn)量較高的目標(biāo)質(zhì)粒。 3．超聲消融聯(lián)合造影劑介導(dǎo)pEGFP-C3(enhanced green fluorescent protein)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞和HUVEC，并檢測轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞活性。 結(jié)果： 1．通過胰酶消化法獲得了穩(wěn)定生長的HUVEC，4天后細(xì)胞迅速生長，集落增大，達(dá)50-60﹪，融合時細(xì)胞鑲嵌排列呈“鋪路石”樣；6天后70-80﹪融合。同時免疫組化鑒定表明獲得的細(xì)胞CD31及

5、FVⅢ相關(guān)抗原的陽性率達(dá)到92﹪以上。 2．在超聲消融儀作用下，HUVEC的轉(zhuǎn)染率較脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染率明顯降低(p<0.05)，但是較無超聲作用組明顯提高(p<0.05)，而且聯(lián)合超聲造影劑后，其轉(zhuǎn)染率又明顯較單純超聲組提高(p<0.05)。單純造影劑并未能促進基因轉(zhuǎn)染。而照射時間(1、10分鐘)的不同也未對轉(zhuǎn)染率產(chǎn)生明顯的影響。 3．噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試驗的檢測表

6、明，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后HUVEC的MTT檢測值與未處理組有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。而單純超聲消融作用1分鐘組與未處理組相比則未見統(tǒng)計學(xué)差異。單純超聲消融作用10分鐘及超聲消融聯(lián)合造影劑組與未處理組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，但是其細(xì)胞活性率仍可達(dá)到90﹪。這可以間接反映不同轉(zhuǎn)染條件對細(xì)胞活性的影響。 結(jié)論： 1．通過胰酶消化法培養(yǎng)出HUVEC細(xì)胞，并利用細(xì)胞的不同生長特點進行細(xì)胞純化的方法所得到的細(xì)胞純度較高，經(jīng)免疫組化檢測證實其為