超聲聯(lián)合SonoVue介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染治療卵巢癌的實驗研究.pdf

1、前言;
　　腫瘤的生長通常伴有新生血管的形成。因此阻斷新生血管的形成尤其是靶向血管基因治療已成為腫瘤治療的發(fā)展方向之一。然而基因治療成功的關(guān)鍵在于找到一種安全、操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高的基因攜帶載體。近年來，超聲聯(lián)合微泡造影劑作為一種新型非病毒載體受到廣泛關(guān)注。超聲聯(lián)合微泡造影劑增強基因轉(zhuǎn)染的前提是不損傷組織和器官，因此合適的輻照條件是非常重要的，但目前尚無定論。
　　KDR啟動子-胸苷激酶自殺基因系統(tǒng)(KDR-TK)是由KDR

2、啟動子驅(qū)動的HSV-TK自殺基因系統(tǒng)。本研究通過裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，探討不同超聲機械指數(shù)(MI)、輻照時間及質(zhì)粒濃度對體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效率的影響，優(yōu)化超聲聯(lián)合SonoVue介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的體內(nèi)實驗條件，提高基因轉(zhuǎn)染的效率。進一步明確在此最優(yōu)實驗條件下超聲聯(lián)合SonoVue介導(dǎo)KDR-TK基因轉(zhuǎn)染治療小鼠卵巢癌的有效性，為卵巢癌靶向血管基因治療提供一種新的基因?qū)敕椒ā?br>　　材料與方法:
　　1、利用人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞

3、系構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型。
　　將濃度為2×106/ml的細(xì)胞懸液按0.2ml/只接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，待成瘤后，選擇腫瘤大小介于0.5cm左右的裸鼠以備實驗所用。
　　2、超聲聯(lián)合微泡造影劑介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染體內(nèi)實驗條件的優(yōu)化
　　將成瘤裸鼠33只，隨機分成11組，每組3只。分別按MI為0.8、1.0、1.2、1.4;按照射時間為1 min、5min、10min、15min;按質(zhì)粒濃度60μg、80μg、120μg進行

4、超聲輻照。輻照后48小時將裸鼠處死剝?nèi)×鼋M織，使用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤內(nèi)GFP轉(zhuǎn)染效率;使用免疫熒光顯微鏡觀察腫瘤內(nèi)GFP熒光表達情況;HE染色觀察裸鼠心、肝、脾、肺、腎組織學(xué)變化;檢測裸鼠血清學(xué)尿素(UREA)、肌酐(CREA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等指標(biāo)。
　　3、超聲聯(lián)合SonoVue介導(dǎo)KDR-TK基因轉(zhuǎn)染治療小鼠卵巢癌的有效性
　　將成瘤裸鼠30只，隨機分成5組，每組6只，A組，對照組加入PBS

5、;B組，KDR-TK+PBS;C組，KDR-TK+ SonoVue;D組，KDR-TK+PBS+超聲照射;E組，KDR-TK+SonoVue+超聲照射。定期測量腫瘤大小計算抑瘤率，并每組選取3只裸鼠觀察其生存時間;RT-PCR定量測量腫瘤內(nèi)TKmRNA表達;抗CD34單抗免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤微血管密度;TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　4、統(tǒng)計學(xué)分析
　　使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表

6、示，采用單因素方差分析(ANOVA)進行比較，LSD檢驗法作兩兩比較。生存分析采用Kaplan-Meier法，各組生存率的比較采用Log Rank法。
　　結(jié)果:
　　1、超聲聯(lián)合微泡造影劑介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染體內(nèi)實驗條件的優(yōu)化
　　(1)當(dāng)MI為1.2時轉(zhuǎn)染效率最高，與其余各組相比較有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，但是其余各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。隨著MI值的升高轉(zhuǎn)染效率并沒有增加。
　　(2)當(dāng)照

7、射時間為10分鐘時轉(zhuǎn)染效率最高，與其余各組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其余各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。從1分鐘到10分鐘，隨著輻照時間的延長，轉(zhuǎn)染效率不斷增加，當(dāng)時間延長到15分鐘時轉(zhuǎn)染效率反而降低。
　　(3)當(dāng)質(zhì)粒濃度為60μg時轉(zhuǎn)染效率最高，與其余各組相比較有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其余各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。隨著質(zhì)粒濃度的升高轉(zhuǎn)染效率沒有增加。
　　(4)當(dāng)MI為1.2，輻

8、照時間為10分鐘，質(zhì)粒濃度為60μg時腫瘤見較多明亮的綠色熒光，而其它條件下腫瘤內(nèi)見少量綠色熒光。裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等其它器官組織內(nèi)均無顯著的熒光表達。
　　(5)當(dāng)機械指數(shù)達到1.4或輻照時間達到15min時，裸鼠血清ALT、AST值明顯升高，血清UREA、CREA值則沒有明顯改變。其余各組血清ALT、AST、UREA、CREA值均沒有改變。
　　2、超聲聯(lián)合SonoVue介導(dǎo)KDR-TK基因轉(zhuǎn)染小鼠卵巢癌的有效性<

9、br>　　(1)治療對各組裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生長的影響
　　C組(KDR-TK+SonoVue/GCV)、D組(KDR-TK+超聲輻照/GCV)、E組(KDR-TK+SonoVue+超聲輻照/GCV)腫瘤體積明顯小于同期對照組(P＜0.001)，且E組腫瘤體積變化更明顯;C組、D組、E組腫瘤生長受到抑制，E組較D組、C組抑瘤作用更明顯，抑瘤率達到60.31％。
　　(2) RT-PCR檢測各組腫瘤細(xì)胞KDR-TK mRNA

10、基因表達水平E組(KDR-TK+SonoVue+超聲輻照/GCV)PCR擴增帶亮度較強，D組(KDR-TK+超聲輻照/GCV)和C組(KDR-TK+SonoVue/GCV)PCR擴增帶亮度較弱，E組與D組、C組比較差異有顯著性(P＜0.001)，D組、C組兩組間比較差異有顯著性(P＜0.001);而B組(KDR-TK)PCR擴增帶亮度最弱，與以上各組比較差異均具有顯著性(P＜0.001)。A組(PBS)未見PCR擴增帶。B組與A組比較差

11、異無顯著性(P＞0.05)。
　　(3)腫瘤微血管密度結(jié)果
　　E組(KDR-TK+SonoVue+超聲輻照/GCV)、D組(KDR-TK+超聲輻照/GCV)、C組(KDR-TK+SonoVue/GCV)均能抑制腫瘤新生血管的生成，但是E組抑制腫瘤新生血管生成的作用強于D組、C組(P＜0.001)。
　　(4) AI檢測結(jié)果
　　E組(KDR-TK+SonoVue+超聲輻照/GCV)、D組(KDR-TK+超聲輻照

12、/GCV)、C組(KDR-TK+SonoVue/GCV)均能明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但是E組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用強于D組、C組(P＜0.001)。
　　(5)荷瘤鼠生存時間分析
　　C組(KDR-TK+SonoVue/GCV)、D組(KDR-TK+超聲輻照/GCV)、E組(KDR-TK+SonoVue+超聲輻照/GCV)裸鼠生存時間延長，與A組(PBS)、B組(KDR-TK)分別比較差異均具有顯著性(P＜0.05);E組裸鼠生存時

13、間明顯延長，與C組比較差異具有顯著性(P＜0.05)。但D組與E組比較差異無顯著性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、超聲介導(dǎo)SonoVue轉(zhuǎn)染GFP體內(nèi)轉(zhuǎn)染最佳條件是:MI為1.2，輻照時間為10min，質(zhì)粒濃度為60μg。
　　2、超聲聯(lián)合SonoVue介導(dǎo)GFP體內(nèi)轉(zhuǎn)染具有較好的靶向性，而且本實驗中最佳體內(nèi)轉(zhuǎn)染條件是安全的。
　　3、超聲聯(lián)合SonoVue能夠介導(dǎo)KDR-TK基因轉(zhuǎn)染卵巢癌裸鼠皮下移植瘤