人低氧誘導(dǎo)因子1α-Ala402-Ala564雙突變型腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的 構(gòu)建能在哺乳動物細(xì)胞得到外源基因高表達(dá)的攜帶HIF-1α-Ala402-Ala564基因的重組腺病毒載體，為HIF-1α基因及其突變型對缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法 采用分子克隆技術(shù)，在業(yè)已完成的pShuttle2-HIF-11α-Ala564的基礎(chǔ)上，用連續(xù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)定點突變的方法將其第402位脯氨酸密碼子CCA突變?yōu)楸彼崦艽a子GCA，構(gòu)建成雙突變HIF-11

2、α真核表達(dá)載體pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564，以PI-Sce Ⅰ和Ⅰ-Ceu Ⅰ雙酶切重組穿梭質(zhì)粒，獲得含有突變型HIF-1αcDNA的表達(dá)盒，通過體外連接法與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-X Viral DNA連接，重組成pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，在HEK293細(xì)胞中包裝成為重組Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒，

3、并進(jìn)行PCR鑒定及滴度測定。 結(jié)果 經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實重組穿梭質(zhì)粒及重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，pShuttle2-HIF-1α-Ala564及pAdeno-HIF-1α-Ala564質(zhì)粒中HIF1α cDNA 402位均為脯氨酸(Pro)密碼子CCA，而突變型pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564及pAdeno-HIF-1α．Ala402-Ala564質(zhì)粒402位則為丙氨酸(Ala)密碼子GCA

4、。對照質(zhì)粒pAdeno-lacZ轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞X-gal染色顯示轉(zhuǎn)染效率約20％。包裝后反復(fù)凍融細(xì)胞3次得到含重組病毒的病毒液，擴增病毒后提取病毒DNA行PCR檢測重組腺病毒均得到預(yù)期的287bp擴增產(chǎn)物，終點稀釋實驗法檢測重組腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564的滴度分別為2.0×10<'8>pfu/ml。 結(jié)論 成功構(gòu)建重組腺病毒雙突變型的Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala56