重組腺病毒三突變型低氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、目前冠心病的發(fā)病率逐年增加，已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一。盡管冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）和冠脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治療進(jìn)展迅速，但仍有一部分患者由于彌漫性或完全性血管閉塞不適于常規(guī)血管成形術(shù)，或因?yàn)樾g(shù)后出現(xiàn)再狹窄、微小血管功能障礙等問(wèn)題必須再尋求其他新的治療途徑。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血管生長(zhǎng)因子經(jīng)安全有

2、效的載體導(dǎo)入或直接注入缺血心肌，可以促進(jìn)血管新生，為缺血性心臟病的治療提供了新的策略。目前已知可能參與血管生成過(guò)程的調(diào)節(jié)因子包括：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血管生成素（angiopoietin，Ang）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，

3、PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示VEGF、FGF蛋白和基因可增加缺血心肌灌注、減小梗死面積、改善心功能，具備安全性、可行性。然而兩者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)并沒(méi)有取得預(yù)期的效果。血管新生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要多種生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)蛋白的參與，而且在血管新生的不同階段

4、，各種生長(zhǎng)因子發(fā)揮的作用也有所不同。單個(gè)生長(zhǎng)因子治療不足以誘導(dǎo)成熟的血管新生。低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作為細(xì)胞對(duì)缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的上游關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)VEGF、PDGF、Ang、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與了血管新生、紅細(xì)胞生成等病理生理過(guò)程。臨床前期研究表明

5、，應(yīng)用具有組成型表達(dá)活性的HIF-1α基因治療可誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生。HIF-1α誘導(dǎo)的新生血管具有無(wú)明顯炎癥反應(yīng)、不滲漏、不引起組織水腫的特點(diǎn)。因此HIF-1α被認(rèn)為是最具有前景的促血管新生治療的基因之一。缺血性心臟病HIF-1α基因治療的優(yōu)勢(shì)在于：HIF-1α可以促進(jìn)VEGF、Ang-1、Ang-2、Ang-4、PDGF、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placenta growth factor，PIGF）等多種基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)血管新生，這些因子

6、相互協(xié)調(diào)、相互拮抗，促進(jìn)生理功能完整的血管新生，避免血管的過(guò)度增殖。其中VEGF是明確的受HIF-1直接調(diào)控的下游靶基因，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，增加血管通透性，使內(nèi)皮細(xì)胞接受刺激因子的作用增加，血漿蛋白外滲，提供血管生成的最初環(huán)境并形成原始血管，對(duì)維持新生血管的存活具有重要作用；而Ang-1、PDGF能夠招募血管周細(xì)胞、促進(jìn)新生血管的成熟和穩(wěn)定；Ang-4在血管成熟期對(duì)維持血管完整性、穩(wěn)定性方面也可能起重要作用；Ang-2通過(guò)拮抗A

7、ng-1而防止血管過(guò)度增殖。PIGF與VEGF具有協(xié)同效應(yīng)，可減少新生血管的滲透。 目的: 為了深入研究HIF-1α基因在血管新生中的作用及Ad-HIF-1α564/402/803的生物學(xué)效應(yīng)，本課題觀察Ad-HIF-1α564/402/803是否能在體外培養(yǎng)的hMVECs穩(wěn)定高效表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管新生的必要條件，通過(guò)研究Ad-HIF-1α564/402/803對(duì)hMVECs增殖及VEGF蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步了解

8、HIF-1α對(duì)血管新生的影響。 方法: 1、將本課題組構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1α nature、Ad-LacZ及空載腺病毒載體Ad-Null，在HEK293A細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增，經(jīng)氯化銫梯度離心法純化，用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒滴度；提取純化后病毒DNA，采用PCR法對(duì)三突變型HIF-1α基因進(jìn)行鑒定。 2、對(duì)hMVECsⅧ因子及CD31相關(guān)抗原進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)；Ad-

9、LacZ以不同轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）轉(zhuǎn)染hMVECs，X-gal染色測(cè)定轉(zhuǎn)染效率；96孔板培養(yǎng)hMVECs，Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1α nature、Ad-Null以最佳MOI轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后第1，2，3，4，5天用MTS方法檢測(cè)不同病毒載體對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 3、Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1α nature、A

10、d-Null以最佳MOI轉(zhuǎn)染hMVECs，分別在48h、72h、96h提取細(xì)胞總蛋白，Western blot方法測(cè)定不同時(shí)間HIF-1α蛋白及72h各組VEGF蛋白表達(dá)量。 4、按MOI為25、75、100、150、300 pfu/cell，Ad-HIF-1α564/402/803轉(zhuǎn)染hMVECs，72h后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot方法測(cè)定HIF-1α及VEGF蛋白表達(dá)量。 結(jié)果: 第一部分：在H

11、EK293A細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增后獲得重組腺病毒Ad-LacZ、Ad-Null、Ad-HIF-1α nature、Ad-HIF-1α564/402/803，純化后終點(diǎn)稀釋法測(cè)得的滴度分別為2．0×1013，2．5×1014，1．6×1012，2．0×1021pfu/ml。重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后24h即出現(xiàn)病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）。提取Ad-HIF-1α564/402/803 DNA，PCR檢測(cè)HIF-

12、1α基因得到預(yù)期的380bp、460bp、214bp的目的片段，且DNA測(cè)序結(jié)果符合預(yù)期。 第二部分：hMVECsⅧ因子及CD31相關(guān)抗原免疫熒光染色均為陽(yáng)性；Ad-LacZ以不同MOI轉(zhuǎn)染hMVECs，X-gal染色顯示MOI為75 pfu/cell時(shí)，轉(zhuǎn)染效率趨于穩(wěn)定。Ad-Null、Ad．HIF-1α nature、Ad-HIF-1α564/402/803轉(zhuǎn)染hMVECs MTS檢測(cè)不同病毒載體及時(shí)間均有顯著性差異（P值分

13、別為0．000），且病毒載體與時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（F=13．956，P=0．000），各組在第1天吸光度無(wú)顯著性差異（F=2．151，P=0．134）；第2、3、4、5天各組均有顯著性差異（P值均為0．000）；在3、4、5天，Ad-Null組吸光度與control組比較無(wú)顯著性差異（P值分別為0．610，0．175，0．514）：Ad-HIF-1α nature組吸光度均顯著高于control組（P值分別為0．001，0．000，0

14、．001，0．000）：Ad-HIF-1α564/402/803組在不同時(shí)間點(diǎn)吸光度均顯著高于Ad-HIF-1α nature組（P值分別為0．000，0．000，0．001，0．000）。 各組在不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α蛋白表達(dá)不同病毒載體與轉(zhuǎn)染時(shí)間均有顯著性差異（P值均為0．000），且兩者存在交互效應(yīng)（F=3．990，P=0．012）。不同組在同一時(shí)間點(diǎn)均存在顯著性差異（P值分別為0．003，0．000，0．001）；在不同

15、時(shí)間點(diǎn)Ad-HIF-1α564/402/803組HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白組及Ad-Null組（P均<0．05），Ad-HIF-1α564/402/803組與Ad-HIF-1α nature組在48h、96h蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P=0．092，0．197），Ad-HIF-1α564/402/803組在72h HIF-1α蛋白表達(dá)顯著高于Ad-HIF-1α nature組（P=0．017），且VEGF蛋白表達(dá)量高于其他組。隨

16、著MOI值的升高，HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)水平呈逐漸增加的趨勢(shì)，當(dāng)MOI為300 pfu/cell時(shí)，蛋白表達(dá)水平較前下降。 結(jié)論: 第一部分：本課題組構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad-LacZ、Ad-Null、Ad-HIF-1α nature、Ad-HIF-1α564/402/803擴(kuò)增后能獲得較高的滴度，且轉(zhuǎn)染效率高，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了保證。 第二部分：Ad-HIF-1α564/402/803對(duì)hMVECs增