突變型人低氧誘導因子1α對大鼠后肢缺血模型的促血管新生作用.pdf

1、研究背景：
　　 冠心病是一種常見的心臟病，是我國城鄉(xiāng)居民的主要死亡原因，并將成為全世界首要的死亡原因和最大的疾病負擔。目前的治療手段主要有藥物治療和包括冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass graft，CABG)及經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)在內(nèi)的血運重建技術(shù)(revascularization)。終末期冠心病患者約占冠心病患者中

2、的10％，因冠狀動脈病變彌漫，或病變血管細小等無條件進行CABG及PTCA治療，藥物治療又不能滿意地控制其心絞痛癥狀，需要尋求一種新的更加適合于他們的治療方法。90年代以來，人們發(fā)現(xiàn)，一些在機體生理和病理性的血管生成中起重要作用的生長因子能夠促進缺血組織的血管新生，加速側(cè)支循環(huán)的建立，有可能通過直接提高缺血區(qū)的血供來改善組織缺血，并設想導入外源性生長因子以促進血管新生，即所謂治療性血管生成(therapeutic angiogenesi

3、s)。這一方法為冠心病的治療提供了新思路。
　　 血管新生(neovascularization)包括vasculogenesis和angiogenesis兩種情況。Vascularogenesis主要是指由胚胎發(fā)育時的angioblast形成的原始血管網(wǎng)絡，繼而出現(xiàn)血管重塑(remodeling)，包括血管內(nèi)皮、平滑肌細胞、支持細胞和細胞外基質(zhì)相互作用，形成完整的血管的過程。Angiogenesis是指從已存在的血管上，通過成

4、熟血管內(nèi)皮細胞增殖、游走，形成新的毛細血管網(wǎng)的過程。血管新生的目的是側(cè)支血管形成并形成血流，以保障所有細胞的充足氧供。在成人缺血性心臟病和腫瘤的缺血缺氧組織中都會有血管數(shù)量的增多，低氧誘導的HIF-1α的激活是主要的分子機制。血管再生(Angiogenesis)、血運重建是一個復雜的病理生理過程，需要有許多血管生長因子的參與，一些大樣本量、隨機、安慰劑對照試驗的結(jié)果提示單一生長因子的上調(diào)作用對于血管生成可能是不足的，成熟的血管形成需要大

5、量不同的細胞類型的相互作用以及后繼的大量生長因子及它們的受體的共同表達。所以，聯(lián)合基因治療成為新的研究熱點。
　　 人低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor1，HIF-1)被公認是一個在應答細胞氧張力變化的基因表達方面的重要調(diào)節(jié)因子，由兩個亞單位組成，氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α和構(gòu)成性表達的亞單位HIF-1β。HIF-1α可調(diào)控下游60多種與血管生長、血管張力、糖代謝、紅細胞生成及干細胞誘導分化等相關的

6、基因。低氧刺激可誘導HIF-1α產(chǎn)生，而HIF-1α可通過促進下游一系列靶基因(如VEGF、VEGFR1、VEGFR2、NOS、IGF-Ⅱ等)的轉(zhuǎn)錄，觸發(fā)機體血管新生的反應，促進側(cè)支循環(huán)的建立，有望誘導生理功能完整的血管新生。
　　 但由于其獨特的結(jié)構(gòu)，HIF-1α只有在低氧條件下才能發(fā)揮功能，其蛋白形式在常氧(21％O2)下5分鐘即發(fā)生降解。主要與氧依賴降解區(qū)(oxygen dependentdegradation domai

7、n，ODDD)564位的脯氨酸(Prolyl，Pro)和402位的脯氨酸(Prolyl，Pro)發(fā)生羥基化有關，在低氧的狀態(tài)下，脯氨酰羥化酶的活性受到抑制，Pro564和Pro402羥基化反應受阻，導致HIF-1α降解途徑中斷，細胞內(nèi)HIF-1α水平增加，與HIF-1β二聚化形成具有生理活性的HIF-1，通過與靶基因如VEGF的低氧反應元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合，進而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。而HIF-

8、1α轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(transactivation domain，TAD)的活性則主要受C-TAD端803位天門冬氨酰(Asparageine，Asn)的羥化調(diào)節(jié)，在常氧下，Asn803可在HIF抑制因子(factor inhibiting HIF-1α，F(xiàn)IH)作用下發(fā)生羥基化，使得C-TAD與轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子CBP/p300的結(jié)合受抑制，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。以上發(fā)現(xiàn)闡明了HIF-1α兩個重要結(jié)構(gòu)區(qū)的功能，為此，《Sincese》曾發(fā)表評

9、論稱“這些發(fā)現(xiàn)將為缺血性心臟病、中風等許多疾病啟開一種新的治療的可能性”。我們先期分別對HIF-1α的關鍵位點Pro564、Pro402和Asn803單一或聯(lián)合定點突變?yōu)锳la564、Ala402和Ala803，獲得了人突變體HIF-1α基因。
　　 為提高外源性基因的轉(zhuǎn)染效率，必須借助于載體。腺病毒因可轉(zhuǎn)染靜止細胞，轉(zhuǎn)染率高，對于非復制狀態(tài)的心肌細胞來說較為適宜；且不整合進染色體，避免了插入突變的危險。雖維持時間較短，但這對于

10、只需短時間表達基因產(chǎn)物的心血管病基因治療來說，更為適合。故我們將人突變體HIF-1α基因成功包裝了腺病毒，獲得了三種不同位點突變的重組腺病毒人突變體HIF-1α基因。
　　 目的：
　　 探討不同位點突變的重組腺病毒人突變體HIF-1α基因(Ad-HIF-1α-Ala564，簡稱Ad-H564；Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402，簡稱Ad-H564/402；Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803，簡稱

11、Ad-H564/803)在大鼠急性下肢缺血模型內(nèi)的表達及對血管新生的影響。
　　 方法：
　　 ①在NEK293A細胞中大量擴增腺病毒、氯化銫濃度梯度離心，透析純化，以獲得高純度、高活性的重組腺病毒人突變體HIF-1α基因。應用電子顯微鏡、PCR、測序等方法鑒定腺病毒基因信息，用分光光度計法測定病毒滴度。②構(gòu)建急性大鼠下肢缺血模型，隨機分為6組，分別以Ad-LacZ、Ad-H0、Ad-H564、Ad-H564/402、A

12、d-H564/803和生理鹽水(NS)轉(zhuǎn)染術(shù)側(cè)下肢骨骼肌，③于轉(zhuǎn)染后1、3、5、7天，RT-PCR測定骨骼肌中HIF-1αmRNA的表達量；④于轉(zhuǎn)染后第28天，用免疫組化的方法檢測骨骼肌中HIF-1α的蛋白表達及CD31蛋白表達；⑤基因轉(zhuǎn)染后28天，選擇性下肢動脈造影及動脈鑄型觀察血管密度。
　　 結(jié)果：
　　 ①經(jīng)過在HEK293A細胞中大量擴增、氯化銫密度梯度離心、透析純化后，各種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因純

13、度提高，滴度達到1011OPU/ml，所攜帶的目的基因信息無丟失或變異，體外實驗顯示轉(zhuǎn)染效率高，未發(fā)現(xiàn)野生型腺病毒產(chǎn)生。②三種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后，均可促進骨骼肌內(nèi)HIF-1αmRNA的表達，且以第7天的表達量最高(F=24.942，P=0.000)；各突變體HIF-1α基因組的表達量均高于野生型HIF-1α基因組(F=99.380，P=0.000)；三種突變體基因組間相比，表達量最高的是Ad-H

14、IF-1α564/402組(0.7952±0.1563，P=0.000)，其次為Ad-HIF-1α564/803組(0.5815±0.0994，P=0.000)，再次為Ad-HIF-1α564組(0.5447±0.1413)。③三種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后第28天，各突變體HIF-1α基因組大鼠的骨骼肌組織間及間質(zhì)組織中均可見明顯的HIF-1α蛋白表達陽性細胞和CD31蛋白表達陽性細胞，且在血管周圍比

15、較密集，微小血管著色更深，與野生型HIF-1α基因組及對照組的差異顯著。；各突變體HIF-1α基因相比，以Ad-H564/803組的最為密集。④三種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后第28天，血管造影及動脈鑄型顯示均可觸發(fā)機體血管新生，促進側(cè)支循環(huán)的建立。雖側(cè)支血管不及野生型HIF-1α基因組的粗大，但末梢可見更多的絨毛樣微細血管；各突變體基因組間相比，以Ad-HIF-1α564/803組的促血管新生作用最強，

16、其次為Ad-HIF-1α564/402組，再次為Ad-HIF-1α564組。
　　 結(jié)論：
　　 ①外源性重組腺病毒人突變體基因Ad-H564、Ad-H564/402、Ad-H564/803均可促進骨骼肌組織中的HIF-1αmRNA的表達和HIF-1α蛋白的表達，且較野生型HIF-1α基因的作用更強。②外源性重組腺病毒人突變體基因Ad-H564、Ad-H564/402、Ad-H564/803轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后第2