ABD蛋白的表達(dá)及對(duì)K562,HL60細(xì)胞的作用研究.pdf

1、研究背景：慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是發(fā)生于造血干細(xì)胞的克隆性惡性腫瘤,1845年Craigie[1]和Bennet[2]在愛(ài)丁堡發(fā)現(xiàn)。在1960年，Nowell和Hunger-ford首先在費(fèi)城發(fā)現(xiàn)CML病人具有獲得性的染色體異常，將這個(gè)異常的染色體命名為費(fèi)城染色體(Philadelphia，Ph[3,4])。1973年，Rowley發(fā)現(xiàn)它是9號(hào)和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂間交互易位的結(jié)果，即t

2、(9,22)(q34；ql1)[5]。1983年以后，證實(shí)了9號(hào)染色體上c-abl與22號(hào)染色體上bcr基因交互易位，在22號(hào)染色體上形成了BCR—ABL融合基因，編碼BCR—ABL融合蛋白，表達(dá)P190，P210，P230融合蛋白，具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，可使一系列信號(hào)蛋白發(fā)生持續(xù)性的磷酸化，導(dǎo)致白血病的發(fā)生[6]。
　　CML病人經(jīng)歷慢性期、加速期、急變期三個(gè)階段，各自的中位數(shù)時(shí)間分別為3～4年；6～9個(gè)月；3～6個(gè)月[7]

3、。目前，CML的治療方法主要有化療、干擾素治療、STi571（甲磺酸伊馬替尼）、干細(xì)胞移植等。傳統(tǒng)的化療手段雖能改善癥狀，緩解病情，但不能阻止疾病的轉(zhuǎn)化，不能從根本上消除惡性克?。桓蓴_素治療血液學(xué)緩解率70～80％，存活期延長(zhǎng)72個(gè)月；異基因骨髓移植(allo-BMT)是目前最有希望治愈慢粒的方法，但有30％～35％患者移植后出現(xiàn)與移植物抗宿主病(GVHD)相關(guān)的致命性并發(fā)癥，另外，患者本身的年齡要求以及不到1/3的患者可找到配型相一致

4、的同胞骨髓供者等因素限制了其臨床應(yīng)用；自體骨髓移植(ABMT)相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率較低，不受年齡限制，但缺乏有效的體外骨髓凈化措施以預(yù)防殘留白血病細(xì)胞導(dǎo)致的復(fù)發(fā)。STi571是一種bcr-abl融合蛋白酪氨酸激酶抑制劑，STi571單獨(dú)或者聯(lián)合干擾素治療有效的CML患者，血液學(xué)緩解率可以達(dá)到90％，已經(jīng)肯定能延長(zhǎng)CML患者生存期，這為CML的靶向治療開(kāi)辟了一個(gè)新的領(lǐng)域，但是STi571的耐藥性問(wèn)題至今無(wú)法解決。
　　目前，眾多的臨床及

5、實(shí)驗(yàn)研究表明，bcr-abl融合基因及其表達(dá)產(chǎn)物bcr-abl融合蛋白是慢性粒細(xì)胞性白血病治療上的特異性靶位[8,9]。隨著對(duì)bcr-abl癌蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的不斷研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到在不同的結(jié)構(gòu)域水平對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行干預(yù),同樣也可以抑制bcr-abl蛋白酪氨酸激酶的活性,這也提示人們繼續(xù)探索更好的慢粒的治療方法。ABD(肌動(dòng)蛋白結(jié)合域，actin binding domain）區(qū)是bcr-abl融合蛋白上C末端的一個(gè)結(jié)構(gòu)域[1

6、0]，研究表明,ABD在BCR/ABLPTK介導(dǎo)的白血病生成中起重要作用[11-13]，白血病的發(fā)生依賴(lài)于碳末端的ABD存在,ABD變異可以降低體外腫瘤細(xì)胞的生存活力[11]，而在體內(nèi)則延遲腫瘤的發(fā)病時(shí)間,因此如果能夠有效調(diào)控ABD區(qū)，就有可能控制bcr-abl融合蛋白的轉(zhuǎn)化活性，從而達(dá)到治療CML的目的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)方法得到ABD片斷,進(jìn)行融合表達(dá),對(duì)ABD的功能進(jìn)行研究,從而為白血病的靶向治療奠定新的分子基礎(chǔ)。
　　實(shí)

7、驗(yàn)?zāi)康模后w外獲得bcr-abl融合基因的ABD區(qū)結(jié)構(gòu)域,進(jìn)行原核表達(dá),并將融合表達(dá)蛋白作用于白血病細(xì)胞系,進(jìn)一步探討其對(duì)白血病的細(xì)胞周期和增殖的影響，為探索CML新的藥物作用靶點(diǎn)和新的治療藥物奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)GenBank中人ABD結(jié)構(gòu)域基因的堿基序列，按照引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)ABD基因設(shè)計(jì)引物。以帶有人類(lèi)慢性粒細(xì)胞白血病bcr-abl基因全長(zhǎng)的PGD210質(zhì)粒[14]為模板,應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出ABD基因的編碼序列，測(cè)序結(jié)果證實(shí)

8、與GenBank中完全一致；將ABD基因的插入到融合有PTD（蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，protein tansductong domain）基因片段的原核表達(dá)載體pET32a中，以獲得PTD-ABD融合基因。將構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET32a-PTD-ABD轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21后，予以IPTG誘導(dǎo)，改變誘導(dǎo)條件，使目的蛋白PTD-ABD在上清中有較大量表達(dá)。大量誘導(dǎo)細(xì)菌，用次氮基三乙酸鎳瓊脂糖（Ni-NTAagarose）親和層析珠對(duì)

9、可溶性目的蛋白進(jìn)行純化。將目的蛋白PTD-ABD與K562細(xì)胞和Hela,HL60細(xì)胞共培養(yǎng)，用免疫熒光和Westernblot的方法觀察和驗(yàn)證目的蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)情況；用光學(xué)顯微鏡和細(xì)胞計(jì)數(shù)研究細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)曲線的變化；MTT、流式細(xì)胞儀技術(shù)研究PTD-ABD融合蛋白對(duì)K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞的增殖和凋亡的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：ABD結(jié)構(gòu)域基因被有效的擴(kuò)增，DNA序列分析表明所構(gòu)建的PTD-ABD融合基因的表達(dá)質(zhì)粒與預(yù)期設(shè)計(jì)相同

10、，ABD、PTD、PTD-ABD融合蛋白得到正確的表達(dá)。且PTD-ABD目的蛋白成功導(dǎo)入K562細(xì)胞和HL60中，能顯著抑制HL60細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且對(duì)HL60細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。
　　實(shí)驗(yàn)討論本研究成功地構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-PTD-ABD，并順利表達(dá)PTD-ABD融合蛋白于上清中。在功能實(shí)驗(yàn)中，研究了目的蛋白對(duì)K562,HL60細(xì)胞的作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為下一步研究目的蛋白的作用機(jī)制，以及為探索CML新的治療藥