雌激素對大鼠急性脊髓損傷后BCL-2、BAX基因表達及細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：研究雌激素對急性脊髓損傷后脊髓組織BCL-2、BAX基因表達及細胞凋亡的影響。 方法：140只成年雄性SD大鼠隨機分為：空白組14只，損傷組42只，雌激素藥物組42只和甲基強的松龍藥物組42只，每組包括1h、4h、8h、1d、3d、5d、7d共7個時間點，空白組每點2只SD大鼠，其余組每點各有6只SD大鼠。按改良Allen’s撞擊法致傷力為50gcf(10g×5cm)損傷T9-T10制作動物模型，大鼠用10％水合氯醛麻醉，

2、無菌條件下以T9-T10為中心做后正中切口，咬除T9-T10棘突及椎板，空白組只暴露脊髓，不損傷脊髓，給予相同劑量生理鹽水，損傷組術(shù)后30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予等量生理鹽水。雌激素藥物組術(shù)后30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予苯甲酸雌二醇[100ug/kg]，每天一次，甲基強的松龍藥物組術(shù)后30分鐘經(jīng)大鼠尾靜脈給予靜注大劑量甲基強的松龍(30mg/kg)，在各個亞組內(nèi)至少有6只動物，不足的應(yīng)及時補充。分別在各時間點處死動物，經(jīng)心臟灌注取材，標本經(jīng)梯度

3、脫水，浸蠟，石蠟包埋，制成6微米厚切片，通過對SCI部位標本進行HE染色觀察鏡下?lián)p傷部位脊髓的病理形態(tài)，同時對受損脊髓部位進行免疫組織化學檢測神經(jīng)細胞凋亡因子BCL-2和BAX基因的表達及用原位末端標記法(TUNEL法)標記神經(jīng)元凋亡細胞，觀察雌激素、甲基強的松龍對大鼠SCI的神經(jīng)保護作用。 結(jié)果：(1)BCL-2在空白組各時間點均未見陽性細胞表達，損傷組和各藥物治療組(Table-3)在SCI傷后4h，損傷部位開始出現(xiàn)較明顯的

4、表達，傷后8h數(shù)量增加，傷后24h達高峰(BCL-2平均光密度值分別為：損傷組0.273±0.043：雌激素組0.396±0.052；甲強龍組0.395±0.057)，分布范圍擴至周圍正常組織，傷后3d開始有減少(BCL-2平均光密度值分別為：損傷組0.207±0.050；雌激素組0.308±0.046；甲強龍組0.301±0.041)，傷后1周基本上只有微弱的陽性表達。BCL-2陽性細胞胞質(zhì)著黃色(Fig.10)，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞均有

5、明顯表達(Fig.11)。統(tǒng)計分析結(jié)果示雌激素組和甲基強的松龍組BCL-2蛋白表達(平均光密度值)比損傷組在相同時間點有明顯差異(P＜0.05)，雌激素組和甲基強的松龍組BCL-2蛋白表達在相同時間點無明顯變化，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各組內(nèi)24h時間點較其它點BCL-2蛋白表達均有明顯差異(P＜0.05，Table-3)。(2)BAX在陰性對照切片上無表達，空白組有少量陽性表達，損傷組和各藥物治療組均在脊髓損傷傷后4h，損傷部位

6、的陽性表達增加(Table-4)，傷后8h損傷部位的陽性細胞數(shù)明顯增多，24h陽性表達達最高峰(BAX平均光密度值分別為：損傷組0.283±0.053；雌激素組0.194±0.047；甲強龍組0.191±0.046)，傷后3d表達開始減少(BAX平均光密度值分別為：損傷組0.191±0.078；雌激素組0.151±0.051；甲強龍組0.164±0.070)，傷后7d表達基本趨于傷前水平。BAX陽性細胞胞質(zhì)著棕黃色(Fig-16)，灰質(zhì)

7、中神經(jīng)元細胞，白質(zhì)中膠質(zhì)細胞均有大量陽性細胞表達。高倍鏡下可見陽性細胞部分呈凋亡形態(tài)，陽性信號主要位于胞漿內(nèi)。圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示雌激素藥物組較損傷組BAX蛋白表達明顯減少，統(tǒng)計分析結(jié)果示雌激素組和甲基強的松龍組BAX蛋白表達比損傷組在同一時間點有明顯差異(P＜0.05)，雌激素組和甲基強的松龍組BAX蛋白表達在相同時間點無明顯變化，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各組內(nèi)24h時間點較其它點BAX蛋白表達均有明顯差異(P＜0.05，T

8、able-4)。(3)空白組零星可見TUNEL陽性細胞，損傷組及藥物治療組均可見大量TUNEL陽性細胞，灰質(zhì)、白質(zhì)內(nèi)均可見，脊髓損傷后4h時陽性細胞較為稀疏，8h，1d和3d時陽性細胞較為稠密，圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，凋亡細胞的數(shù)量在各時間點有明顯差異(P＜0.05，Table-5)，8h時達高峰(損傷組31.5±5.0；雌激素組26.8±4.6；甲強龍組27.4±4.7單位：個/mm2)，以后稍有下降，3d后即開始迅速下降(損傷組2

9、5.2±4.2；雌激素組20.3±5.8；甲強龍組20.9±3.1單位：個/mm2)，7d時仍有少量凋亡細胞。圖象分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示雌激素藥物組較損傷組細胞凋亡數(shù)明顯降低，相關(guān)分析結(jié)果豆示有明顯差異(P＜0.05)，雌激素組和甲基強的松龍組細胞凋亡數(shù)無明顯變化，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(4)BCL-2/BAX值在各時間點同樣有明顯差異(P＜0.05，Table-6)，傷后8h和1d時較小，以后逐漸增大，5d和7d時趨于穩(wěn)定。各數(shù)

10、值結(jié)果顯示BCL-2/BAX值在8h小時最小(損傷組0.954±0.1 72；雌激素組1.720±0.354；甲強龍組1.715±0.328)，此時凋亡的細胞數(shù)最多(損傷組31.5±5.0；雌激素組26.8±4.6；甲強龍組27.4±4.7單位：個/mm2)，以后隨著BCL-2/BAX值逐漸增大，細胞凋亡的數(shù)也逐漸下降(Table-7)，對于損傷組各時間點相關(guān)分析結(jié)果顯示，BCL-2/BAX值與細胞凋亡數(shù)呈負相關(guān)(R=-0.79,P＜0