DDFA對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肝臟細(xì)胞凋亡及Bax，Bcl-2基因表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景： 急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是臨床上一種表現(xiàn)兇險(xiǎn)、死亡率高的急腹癥之一，也是最易發(fā)生多器官功能障礙綜合癥(MODS)的疾病之一，并發(fā)MODS成為本病的主要死亡原因。重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)不但累及胰腺，而且累及肝、肺及腎臟等遠(yuǎn)處器官。肝臟作為主要的受損器官，在病變加重時(shí)可發(fā)展成為肝衰竭，一旦肝功能衰竭發(fā)生，就會(huì)導(dǎo)致死亡。此外，由于其具有復(fù)雜的生

2、理功能以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，肝臟在AP病情發(fā)展中具有十分特殊的作用。方馳華首先應(yīng)用DDFA方案治療SAP取得明顯效果，但是其作用機(jī)制并不明確。地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗菌、抗休克、抗過(guò)敏等重要藥理作用。低分子右旋糖酐是葡萄糖聚合物的膠體溶液，通過(guò)其膠體滲透壓產(chǎn)生擴(kuò)容、抗凝、改善微循環(huán)作用。5-Fu治療AP的作用，主要是通過(guò)抑制胰腺外分泌而發(fā)揮作用的。抑肽酶可以明顯降低急性胰腺炎血漿及胰組織勻漿內(nèi)淀粉酶及脂肪酶濃度，且使胰腺的病

3、理變化減輕，說(shuō)明抑肽酶抑制了急性胰腺炎的高分泌狀態(tài)，使胰腺的自身消化程度明顯減輕。有研究表明AP大鼠發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞有凋亡發(fā)生，并且肝細(xì)胞凋亡可能是肝細(xì)胞功能衰竭的重要原因。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的，而細(xì)胞凋亡調(diào)控基因中最受關(guān)注的就是Bcl-2家族。DDFA治療方案對(duì)大鼠SAP的肝細(xì)胞凋亡有何作用?相關(guān)的調(diào)控基因?qū)Ω渭?xì)胞的凋亡又是如何調(diào)控的?此研究著重于觀察DDFA治療方案對(duì)肝臟細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因的影響，探討DDFA的作用機(jī)制。 目

4、的： 探討重癥急性胰腺炎大鼠肝臟細(xì)胞凋亡和凋亡調(diào)控基因Bax和Bcl-2的變化及應(yīng)用DDFA治療對(duì)細(xì)胞凋亡和凋亡調(diào)控基因的影響，從而了解細(xì)胞凋亡在SAP肝臟損傷中的作用以及DDFA治療SAP肝臟損傷的部分機(jī)制。 方法： SD大鼠57只，雌、雄不限，體重250g～300g。實(shí)驗(yàn)分組：假手術(shù)組9只；SAP組24只；DDFA治療組24只。每組再分為6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配3只大鼠，SAP組

5、和DDFA治療組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分配8只大鼠。SAP組以胰尾被膜下穿刺注射50g/L牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)制作重癥急性胰腺炎模型。DDFA組于模型誘發(fā)后，經(jīng)頸靜脈注射地塞米松(0.05mg/100g)+右旋糖酐(4ml/100g)+5-Fu(4mg/100g)+抑肽酶(5000U/100g)；假手術(shù)組僅牽拉胰腺。 各組在6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，心臟穿刺抽血，進(jìn)行BIL、AST、ALT測(cè)定；經(jīng)原切口入腹取肝臟組織，以10％(10

6、0ml/L)中性緩沖甲醛液固定后，石蠟包埋，每蠟塊行4μm厚連續(xù)切片。HE染色光鏡下觀察肝臟的病理變化。 采用DNA末端原位標(biāo)記法(TUNEL法)，光鏡下計(jì)算肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)(ApoptoticIndex，AI)。AI計(jì)算方法：數(shù)4個(gè)高倍視野，分別計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％；免疫組化SABC法檢測(cè)肝臟組織中基因BaxBcl-2蛋白表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料值以-x±s顯示，各組均數(shù)

7、比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，SAP組與SO、DDFA組組間兩兩比較用Dunnett法，細(xì)胞凋亡與肝功能改變的關(guān)系用相關(guān)分析。P＜0.05為差異有顯著性意義。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS10.0。 結(jié)果： HE染色后各組光鏡下所見(jiàn)：假手術(shù)組未見(jiàn)異常；SAP組6h時(shí)肝臟輕度腫脹，肝臟細(xì)胞輕度水腫；12h時(shí)肝臟腫脹加重伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)改變；24h時(shí)肝臟可見(jiàn)局灶性或不規(guī)則片狀壞死，肝竇及匯管區(qū)周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及散在紅細(xì)胞；DDF

8、A組各時(shí)間點(diǎn)鏡下所見(jiàn)均較SAP組減輕。 SAP時(shí)BIL、AST、ALT明顯升高，且隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高；應(yīng)用DDFA治療后，BIL、AST、ALT下降，但仍有隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高的趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SAP組與SO、DDFA組組間兩兩比較用Dunnett法有顯著性差異(P＜0.05)。 TUNEL染色結(jié)果表明：SAP組凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡指數(shù)升高，并隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高，DDFA組凋亡指數(shù)較SAP組明顯下降。統(tǒng)計(jì)學(xué)處

9、理SAP組與SO、DDFA組組間兩兩比較用Dunnett法有顯著性差異(P＜0.05)。 假手術(shù)組Bax、Bcl-2基因的表達(dá)均較弱；SAP組Bax基因有表達(dá)，尚隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增高，Bcl-2表達(dá)值隨著病程延長(zhǎng)而逐漸下降；DDFA組與SAP組比較，Bax基因表達(dá)明顯下調(diào)，而B(niǎo)cl-2基因表達(dá)明顯上調(diào)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SAP組與SO、DDFA組組間兩兩比較用Dunnett法有顯著性差異(P＜0.05)。 相關(guān)分析顯示細(xì)胞凋亡

10、指數(shù)與肝功能指標(biāo)變化(AST、ALT、BIL)呈明顯正相關(guān)。 結(jié)論： SAP大鼠肝臟損傷至少部分是通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制引起的，即細(xì)胞凋亡是造成SAP肝臟損害的重要因素之一。 DDFA治療大鼠重癥急性胰腺炎可以明顯地改善大鼠病變的肝臟組織形態(tài)和肝功能的水平； DDFA治療重癥急性胰腺炎的機(jī)制之一可能是阻止損傷的肝臟細(xì)胞調(diào)亡。DDFA的作用機(jī)制可能是抑制Bax基因表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2基因表達(dá)從而影響細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的