GJB2與mtDNA A1555G基因檢測(cè)及其與臨床表型相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分：無(wú)創(chuàng)性GJB2基因與mtDNAA1555G突變檢測(cè)體系的建立
　　第一章：口拭子刮取口腔頰粘膜脫落細(xì)胞用于聾病基因檢測(cè)可行性研究
　　目的：探討口拭子刮取口腔頰粘膜脫落細(xì)胞無(wú)創(chuàng)、便捷DNA采樣方式用于聾病基因檢測(cè)的可行性。
　　方法：隨機(jī)收集門(mén)診聾兒98例，分別采用無(wú)創(chuàng)的口拭子刮取口腔頰粘膜脫落細(xì)胞和抽取2ml靜脈血兩種方式采集標(biāo)本，提取基因組DNA后遵循盲法原則，分別對(duì)常見(jiàn)聾病基因GJB2，線粒體基因155

2、5A>G(mtDNA A1555G)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果通過(guò)Kappa檢測(cè)進(jìn)行一致性分析。
　　結(jié)果：無(wú)創(chuàng)的口拭子刮取口腔頰粘膜脫落細(xì)胞和有創(chuàng)的抽取靜脈血兩種方式采樣后24h內(nèi)提取基因組DNA一次成功率分別為98.98％和100％，DNA獲得量分別為2.16±0.44μ g和21.47±4.59μ(500μ l血)，OD值260/280分別為1.82±0.13和1.79±0.11.口拭子采樣24h后和1周后提取得率有明顯差異，t=

3、2.52，p=0.01，血樣則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而血樣在提取1周和1月后得率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=2.87，p=0.01：GJB2及mtDNA A1555G基因檢測(cè)結(jié)果一致(kappa=1.00，P=0.00)，共發(fā)現(xiàn)GJB2突變的占27.56％(27/98)，mtDNA A1555G占4.08％(4/98)。
　　結(jié)論：口拭子刮取口腔頰粘膜脫落細(xì)胞可以用于聾病基因GJB2及mtDNAA1555G檢測(cè)，以該方法可靠、無(wú)創(chuàng)、便捷，可以在

4、大規(guī)模聾病基因檢測(cè)特別是小年齡檢測(cè)對(duì)象中推廣應(yīng)用，特別是適用于新生幾早期聾病基因篩查。
　　第二章：建立高分辨率熔解曲線分析結(jié)合基因測(cè)序二步法GJB2基因檢測(cè)體系
　　目的：建立以高分辨率熔解曲線分析法(High Resolution Melt，HRM)結(jié)合基因測(cè)序法為基礎(chǔ)的GJB2基因檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)廉價(jià)、快速、結(jié)果可靠的檢測(cè)目標(biāo)。
　　方法：從復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院耳鼻喉科門(mén)診患兒中隨機(jī)選擇感音神經(jīng)性聾兒121例和聽(tīng)力

5、正常新生兒72名，平均年齡分別為2歲4月和1.1月，遵循盲法原則分別以HRM結(jié)合基因測(cè)序二步法與直接測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，并采用Kappar分析比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。
　　結(jié)果：HRM結(jié)合基因測(cè)序二步法檢測(cè)結(jié)果為：聾兒組和聽(tīng)力正常組陰性樣品分別有24例和58例，可疑突變樣品分別有97例和14例，對(duì)可疑突變樣品進(jìn)行基因測(cè)序，最終確定各樣品基因型共發(fā)現(xiàn)聾兒組中GJB2雙鏈突變的占46.28％(56/121)，單鏈突變占37.19％(

6、45/121)野生型占22.31％(27/121)，聽(tīng)力正常組中單鏈突變占9.72％(7/72)，野生型占90.28％(65/72)，未見(jiàn)雙鏈突變者：直接測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果：對(duì)兩組樣品盲法編號(hào)后，直接測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與前者一致，Kappa值為1，p=0.00。HRM成本約為PCR基礎(chǔ)上增加不足0.5元，而基因測(cè)序費(fèi)用為增加20-25元，檢測(cè)耗時(shí)分別為15分鐘和10h左右，HRM結(jié)合基因測(cè)序二步法使病例組19.83％(24/121)和對(duì)照

7、組80.56％(58/72)僅通過(guò)HRM檢測(cè)而無(wú)需進(jìn)行基因測(cè)序即可完成檢測(cè)。
　　結(jié)論：HRM法結(jié)合基因測(cè)序法檢測(cè)GJB2基因具有廉價(jià)、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，可應(yīng)用于GJB2基因大規(guī)模臨床檢測(cè)，為明確耳聾病因、降低聾兒出生率提供一種技術(shù)支持。
　　第三章：定量連接酶連反應(yīng)在mtDNA A1555G點(diǎn)突變檢測(cè)中的應(yīng)用
　　目的：建立以定量連接酶連反應(yīng)(quantitative ligase chain reactio

8、n，Q-LCR)為基礎(chǔ)的mtDNA A1555G點(diǎn)突變?cè)\斷技術(shù)，實(shí)現(xiàn)廉價(jià)、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)目標(biāo)。
　　方法：從復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院耳鼻喉科門(mén)診中隨機(jī)選擇感音神經(jīng)性聾兒121例及聽(tīng)力正?；純?0例，針對(duì)mtDNA A1555G點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)相應(yīng)的探針和引物，建立穩(wěn)寫(xiě)的檢測(cè)體系，遵循雙盲法原則分別以Q-LCR法和酶切法進(jìn)行檢測(cè)，用Kappa分析比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。
　　結(jié)果：Q-LCR法檢測(cè)結(jié)果為：聾兒組中攜帶mtDNA A1555

9、G點(diǎn)突變的占4.01％(5/121)。聽(tīng)力正常組中未見(jiàn)攜帶mtDNA A1555G點(diǎn)突變者：酶切法檢測(cè)后結(jié)果與Q-LCR法一致：經(jīng)Kappa分析兩種檢測(cè)方法結(jié)果完全一致，未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。
　　結(jié)論：所建立的Q-LCR法檢測(cè)mtDNA A1555G點(diǎn)突變具有價(jià)格便宜，操作快捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，可應(yīng)用于我國(guó)mtDNA A1555G突變的大規(guī)模篩查，為明確聾兒病因，降低聾生出生率，預(yù)防藥物性耳聾的發(fā)生提供一種很好的方法。

10、>　　第二部分：先天性聾兒GJB2及mtDNA A1555G突變分子流行病學(xué)研究
　　目的：明確GJB2基因及mtDNA A1555G突變?cè)谏虾＜爸苓叺貐^(qū)先天性聾兒和新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(Neonatal intensive care unit NICU)新生兒中的突變率及突變熱點(diǎn)分布情況。
　　方法：收集復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院耳鼻喉科門(mén)診發(fā)病年齡小于1歲的聾兒183例，NICU入院大于48h的新生兒484例，口拭子刮取口腔頰粘膜脫

11、落細(xì)胞取得DNA樣本，用HRM結(jié)合基因測(cè)序二步法檢測(cè)GJB2基因，用Q-LCR法檢測(cè)mtDNA A1555G突變，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以明確GJB2基因和mtDNAA1555G在聾兒組和NICU對(duì)照組中的分布情況。
　　結(jié)果：聾兒組183例中共檢測(cè)出148例GJB2基因有改變，占80.871(148/183)，共檢測(cè)出12種突變方式，其中致病突變7種(235delc、299-300delAT、571T>C、605ins46、22

12、3C>T、224G>A、232G>A)，多態(tài)性突變2種608T>C、79G>A，致病性有爭(zhēng)議的突變3種(79G>A+341A>G、109G>A、509A>G)，攜帶GJB2致病性純合突變或雙重雜合致病性突變(含3種有爭(zhēng)議的突變類型)的雜合個(gè)體共有58例，占31.69％，僅攜帶一條GJB2致病性突變的有74例，占40.44％。不攜帶GJB2突變或僅攜帶多態(tài)性突變的有51例，占27.87％；NICU對(duì)照組484例中共檢測(cè)出207例GJB2基

13、因序列有改變，占42.77％，共檢測(cè)出4種突變方式，其中致病突變有1種(235delC)，多態(tài)性突變1種79G>A，致病性有爭(zhēng)議的突變2種(79G>A+341A>G和109G>A)，79G>A+341A>G純合突變5例，占1.03％，僅攜帶一條GJB2致病性突變的有169例，占34.92％。不攜帶GJB2突變或僅攜帶多態(tài)性突變的有310例，占64.05％。mtDNA A1555G突變?cè)诿@兒組中有5例攜帶者，占2.73％，而NICU組中未

14、發(fā)現(xiàn)突變陽(yáng)性者。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)特別是在上海及周邊地區(qū)的先天性聾兒中，235delC、299-300delAT、109G>A、79G>A+341A>G等為常見(jiàn)的突變熱點(diǎn)；支持109G>A、79G>A+341A>G這兩個(gè)有爭(zhēng)議的突變形式為耳聾的致病性突變；首次發(fā)現(xiàn)在聾病患者中發(fā)現(xiàn)509A>G同時(shí)伴235delc、223C>T同時(shí)伴79G>A這兩種新型突變方式，另外在中國(guó)非顯性遺傳家系中首次發(fā)現(xiàn)了以往認(rèn)為是顯性遺傳的突變方

15、式224G>A和232G>A；mtDNA A1555G在本研究中發(fā)現(xiàn)其發(fā)生率約為2.73％，低于已報(bào)道的平均水平，提示該突變作為一種藥物易感性突變可能在先天性耳聾不起主要作用；本研究為開(kāi)展GJB2基因和mtDNA A1555突變臨床檢測(cè)提供了依據(jù)。
　　第三部分：GJB2及 mtDNAA1555G突變致聾早期聽(tīng)力學(xué)特征研究
　　目的：探討GJB2與mtDNAA1555G基因突變致聾早期的聽(tīng)力學(xué)特征，為聾病的臨床診斷，預(yù)防和干

16、預(yù)提供依據(jù)。
　　方法：隨機(jī)收集復(fù)旦大學(xué)兒科醫(yī)院耳鼻喉科門(mén)診中感音神經(jīng)性聾兒183例，年齡范圍在0-4歲，發(fā)病年齡在1歲以內(nèi)。對(duì)照組30例年齡范圍在0-3歲。收集入選對(duì)象病史資料，聽(tīng)力學(xué)信息(聲阻抗、耳聲發(fā)射、短聲聽(tīng)性腦干反應(yīng)、多頻穩(wěn)態(tài)反應(yīng)等)以及GJB2、mtDNAA15556基因檢測(cè)情況，按GJB2致聾組、mtDNAA15556致聾組、非GJB2/mtDNAA1555G致聾組以及正常對(duì)照組進(jìn)行分組研究，分析不同致病基因所引起的

17、聽(tīng)力損傷早期的聽(tīng)力學(xué)特征。
　　結(jié)果：GJB2致聾組、mtDNA A1555G致聾組及非GJB2/mtDNA A1555G致聾組發(fā)病年齡分別為1.03±2.32月、2.54±9.32月、2.43±4.32月GJB2致聾組發(fā)病早，t=2.43，p<0.01；三組患兒生后3天初篩通過(guò)率分別為6.03％，10.00％，12.08％，42天復(fù)篩通過(guò)率分別為4.13％、10.00％、3.75％；GJB2致聾組中聽(tīng)力損失在中度及中度以下者有1

18、9.83％(23/116)，而mtDNA A15556致聾組僅有10.00％(1/10)，其它組有30.84％(74/240)；GJB2致聾組51耳在刺激聲強(qiáng)度為109.6dBnHL時(shí)能引出清晰Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波，6月內(nèi)Ⅰ、Ⅲ波潛伏期及Ⅰ-Ⅴ波間期延長(zhǎng)，6-12月時(shí)各波及波間期均延長(zhǎng)，此類聾兒早期聽(tīng)力呈進(jìn)行性下降；各組聾兒在ASSR250Hz、500Hz、1000Hz、2000Hz、4000Hz各頻率引出率高于ABRⅤ波，GJB2致聾組在低頻