GJB2基因條件敲除小鼠耳蝸凋亡相關(guān)基因表達(dá)差異研究.pdf

1、耳聾是導(dǎo)致人類言語(yǔ)交流障礙的主要疾病，在中國(guó)人中，GJB2基因突變導(dǎo)致的先天性耳聾大約為12.2％，在NSHL未成年患者中GJB2基因突變的陽(yáng)性檢出率高達(dá)20.1%，該基因突變是導(dǎo)致人類非綜合征性聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）的主要原因，研究其致病機(jī)制意義重大。研究表明GJB2基因條件敲除小鼠（cCx26Pax2Cre小鼠）出生后出現(xiàn)耳蝸細(xì)胞缺失，凋亡可能是GJB2基因敲除后耳蝸細(xì)胞缺失的主要原因，但

2、是目前有關(guān)具體凋亡機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)cCx26Pax2Cre小鼠凋亡相關(guān)84個(gè)基因表達(dá)變化情況進(jìn)行觀察分析，探討GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾的機(jī)制。
　　一、 cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸凋亡相關(guān)84個(gè)基因差異表達(dá)研究
　　我們選取cCx26Pax2Cre小鼠為實(shí)驗(yàn)組，野生型BALB/C小鼠作為正常對(duì)照組，取 P10和P18時(shí)小鼠，提取耳蝸膜迷路總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用QRT-PCR Array檢測(cè)凋亡相關(guān)

3、的84個(gè)功能基因的表達(dá)差異。選取小鼠耳蝸組織中表達(dá)最為穩(wěn)定的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照。結(jié)果顯示：與野生型小鼠相比，在P10時(shí)，一共有16個(gè)基因表達(dá)有生物學(xué)意義（19.05%），14個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(87.5%)，其中9個(gè)下調(diào)基因?yàn)橐种萍?xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因，5個(gè)基因?yàn)榇龠M(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的基因；2個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（12.5%），均為

4、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。在P18時(shí)，與野生型小鼠相比，一共有4個(gè)基因(4.76%)表達(dá)變化有生物學(xué)意義，其中3個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（75%），全部為抑制細(xì)胞凋亡的基因（100%）；1個(gè)基因（Tnfrsf10b）表達(dá)上調(diào)（25%），為促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。與P10相比，P18時(shí)耳蝸組織中caspase-8表達(dá)上調(diào)。Bcl2l10和Tnfrsf10b在P10、P18兩個(gè)發(fā)育階段的變化均具有生物學(xué)意義，而且促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Tnfrsf10b基因兩個(gè)時(shí)間段均

5、表達(dá)上調(diào)。
　　二、死亡受體5（Death receptor, DR5）在cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸的表達(dá)的研究
　　選取P8、P12、P21小鼠用熒光標(biāo)記的免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)表達(dá)上調(diào)的差異表達(dá)基因DR5（由Tnfrsf10b基因編碼）在耳蝸表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示DR5在cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸支持細(xì)胞、毛細(xì)胞、螺旋韌帶 II型纖維細(xì)胞、螺旋凸、螺旋緣、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿和胞膜、螺旋緣下方蝸軸螺旋管內(nèi)神經(jīng)纖

6、維、蓋膜均有較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)，隨小鼠日齡增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而在野生型小鼠耳蝸， DR5表達(dá)表現(xiàn)出不同的方式，先后在蓋膜、耳蝸支持細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、螺旋凸處可見(jiàn)表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度均弱于相應(yīng)日齡的基因敲除小鼠。與野生型小鼠相比，cCx26Pax2Cre小鼠耳蝸神經(jīng)纖維 DR5表達(dá)的光密度值明顯增大，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異具有顯著性意義（P<0.05）。
　　我們推測(cè)在 cCx26Pax2Cre小鼠縫隙連接功能異常，可能導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞出現(xiàn)葡萄