藥物性耳聾相關(guān)線粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、耳聾是導(dǎo)致言語交流障礙最常見的疾病,據(jù)世界衛(wèi)生組織2006年估計,全球范圍有2.78億人患有耳聾和其他聽力問題,而據(jù)中國殘疾人聯(lián)會抽樣調(diào)查顯示我現(xiàn)有聽力殘疾的個體超過2057萬,其中7歲以下兒童聽力障礙者80萬。耳聾是由遺傳和環(huán)境因素引起的,其中50％是由遺傳因素造成的。由遺傳因素引起的耳聾包括綜合征型耳聾(占30％)和非綜合征型耳聾(70％),根據(jù)遺傳方式的不同非綜合征型耳聾進(jìn)一步分為:常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、性染色體遺傳

2、和母系遺傳。調(diào)查顯示,耳聾患者中有3.4％是由個體體質(zhì)敏感使用了耳毒性藥物而引起,耳毒性藥物如氨基糖甙類抗生素,主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等等。這些藥物原理是與細(xì)菌線粒體中核糖體16S rRNA結(jié)合,使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成異常,進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌正常的生理活動受阻,以達(dá)到抗菌目的。相關(guān)研究證實人類線粒體基因(mtDNA)12S rRNA中A1555G突變和C1494T突變會在12S rRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1

3、494U-A1555堿基對,這些改變使得12S rRNA在二級結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌的16SrRNA的相應(yīng)區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)更加相似,如果用藥本人攜帶這種基因突變,可能就會導(dǎo)致藥物識別錯誤,“攻擊”健康的耳內(nèi)細(xì)胞,進(jìn)而致使耳內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成異常,突變攜帶者在接觸氨基糖甙類藥物后便出現(xiàn)了聽力損失的情況。據(jù)測算,我國這些突變的基因攜帶者總數(shù)達(dá)到100萬之多,這一群體顯然是預(yù)防耳聾的重點對象。但是,目前傳統(tǒng)的檢測技術(shù)存在著檢測周期較長,檢測程序較繁瑣、費

4、用昂貴和不易推廣等問題,因此,建立特異、敏感、快速的耳聾相關(guān)性線粒體基因的突變診斷技術(shù),不僅能提高診斷流程速度,節(jié)約生物制劑資源,而且能以更有效、更快捷、更科學(xué)地預(yù)防耳毒性藥物致聾現(xiàn)象的發(fā)生,因此十分具有社會和經(jīng)濟(jì)意義。
　　 本研究探索建立了同時檢測耳聾相關(guān)的線粒體基因最重要的兩個突變位點A1555G和C1494T的快速診斷方法,并利用本快速診斷方法對浙江省的部分樣品進(jìn)行檢測。本研究主要包括以下兩部分:
　　 第一部分

5、藥物性耳聾相關(guān)的線粒體基因A1555G和c1494T突變快速診斷方法的建立
　　 目前國內(nèi)外傳統(tǒng)的母系遺傳性耳聾基因檢測方法有PCR直接測序、酶切鑒定法、熒光定量PCR檢測等等,雖然檢測方法繁多,其科學(xué)性、靈敏性也足夠能保證檢測結(jié)果的正確性,但是這些檢測方法也有其固有的自身缺陷,比如試驗過程漫長、檢測步驟冗多、實際操作繁瑣和試劑成本偏高等,因此大范圍地應(yīng)用于臨床顯得比較不切實際。本研究利用特異性PCR和多重PCR技術(shù)建立同時對藥

6、物性耳聾相關(guān)的線粒體基因A1555G和C1494T突變的快速診斷方法,其試驗流程簡便快速,結(jié)果判讀直觀明了,試劑使用量化節(jié)約,新研究成立的診斷方法應(yīng)用于檢測線粒體基因A1555G和C1494T突變具備高度的特異性和敏感性。研究運用檢測帶毛囊的毛發(fā)進(jìn)行試驗,建立起一種對人體無傷害、無痛苦的獲取耳聾患者基因組DNA的方法以及一種快速、簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的藥物性耳聾相關(guān)基因突變檢測方法,以滿足對mtDNA A1555G和C1494T突變進(jìn)行廣泛

7、篩查的需要。
　　 第二部分藥物性耳聾相關(guān)的線粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法的應(yīng)用
　　 本研究的對象是浙江溫州和寧波地區(qū)3個攜帶A1555G突變的母系遺傳性耳聾家系和1個攜帶C1494T突變的母系遺傳藥物性耳聾家系,這4個家系均為母系遺傳性耳聾家系,每個家系中均有患者使用過氨基糖甙類抗生素(AmAn)。這兩個家系受檢人數(shù)為19人,同時,我們也選擇了15名無遺傳關(guān)聯(lián)的散發(fā)性耳聾患者毛囊樣本,我們分別對

8、這34個標(biāo)本進(jìn)行檢測。在試驗過程中,我們使用新建立的藥物性耳聾相關(guān)的線粒體基因A1555G和C1494T突變快速診斷方法對全部34名受檢者的標(biāo)本進(jìn)行檢測,進(jìn)行多重等位因特異性PCR擴(kuò)增,同時,所有被檢者個體的線粒體基因均進(jìn)行PCR直接測序分析。在所有受檢者中共檢出16例陽性,陽性率為47.1％,并且新診斷方法應(yīng)用的多重等位基因特異性PCR擴(kuò)增鑒定檢測結(jié)果與直接測序結(jié)果完全相吻合,符合度達(dá)到100％。由于試驗并不需要投入大量的設(shè)備資源和人