自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞修復(fù)兔高壓電損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]各種損傷包括高壓電損傷引起的肌肉組織缺損目前尚無(wú)理想的治療方法。組織工程修復(fù)將是未來(lái)發(fā)展的方向。本課題通過(guò)體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rabbitbonemarrowmesenchymalstemcells，rMSC)并向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，以及誘導(dǎo)分化后的成肌細(xì)胞移植修復(fù)兔高壓電損傷后的肌肉缺損，研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，利用組織工程技術(shù)修復(fù)電損傷后肌肉缺損的可行性，為進(jìn)一步利用組織工程技術(shù)完美修復(fù)電損傷提供實(shí)

2、驗(yàn)依據(jù)。 [方法]本課題實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括3個(gè)部分。第一部分，兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSC)的分離和體外培養(yǎng)與擴(kuò)增。第二部分，體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化。第三部分，分化后的成肌細(xì)胞移植修復(fù)兔高壓電損傷。其中第一部分采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖能力；第二部分選用5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-aza)為誘導(dǎo)劑，對(duì)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增后的兔骨

3、髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在5-aza誘導(dǎo)下的變化；第三部分，收集分化后的細(xì)胞移植于兔高壓電損傷肌肉進(jìn)行性壞死動(dòng)物模型，觀察修復(fù)治療效果 [結(jié)果]1.體外培養(yǎng)出兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代3次體外培養(yǎng)第1天，兔骨髓MSC呈小圓形，單個(gè)核細(xì)胞，懸浮于培養(yǎng)液表層；第3天部分細(xì)胞呈梭形延展，并貼附于瓶底，可見(jiàn)核分裂現(xiàn)象；第5天貼壁細(xì)胞增多，并呈極性生長(zhǎng)，可見(jiàn)分裂的細(xì)胞核，部分連接成片；第7天可見(jiàn)貼壁的細(xì)胞多數(shù)連接成片

4、，核分裂現(xiàn)象布滿視野；第9天則大部分瓶底都有貼壁MSC細(xì)胞生長(zhǎng)，并開(kāi)始呈纖維狀排列；第12天貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，呈纖維狀規(guī)則排列。體外傳代培養(yǎng)的兔MSC細(xì)胞形態(tài)學(xué)與原代細(xì)胞大致相似，生長(zhǎng)稍快。傳代3次后的第3代細(xì)胞仍保持增殖能力。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34陰性CD44陽(yáng)性。 2.體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在5-aza誘導(dǎo)下向成肌細(xì)胞分化在用含有5-aza的DMEM培養(yǎng)基對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外連續(xù)誘導(dǎo)24h后，繼續(xù)培

5、養(yǎng)7天開(kāi)始，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)長(zhǎng)梭形肌管樣結(jié)構(gòu)，部分融合，第12天現(xiàn)出現(xiàn)成肌細(xì)胞的特征，用免疫組化檢測(cè)Desmin染色陽(yáng)性。 3.誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞移植兔高壓電損傷后的骨骼肌缺損部位時(shí)，缺損被修復(fù)。收集誘導(dǎo)分化的成肌細(xì)胞注射到兔高壓電損傷動(dòng)物模型骨骼肌缺損部位，缺損的骨骼肌得以修復(fù)。 [結(jié)論]本課題研究表明密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)能在體外分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并在體外連續(xù)培養(yǎng)及傳代，在5-aza誘導(dǎo)下可以向成肌細(xì)胞分化，