骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化及大鼠間異體移植的研究.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有向成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種成熟細(xì)胞分化的潛能，其來源豐富，分離、培養(yǎng)較為容易，在體外可多次擴(kuò)增，自體移值不俘在組織配型及免疫排斥的問題。由于MSCs具有上述優(yōu)點(diǎn)，使其引起了廣泛的關(guān)注，尤其是組織修復(fù)方面，可將其應(yīng)用于器官及組織的修復(fù)治療中。本實(shí)驗(yàn)通過研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同條件下分離、純化、傳代、鑒定及誘導(dǎo)，得出培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件。并進(jìn)一步用5-氮雜

2、胞苷(5-Aza-CR)誘導(dǎo)其向成肌細(xì)胞分化，將誘導(dǎo)后的干細(xì)胞用BrdU標(biāo)定，移值入SD大鼠膀胱肌層，觀察其在膀胱肌層的存活及分布狀況。
　　方法：(1)MSCs的分離培養(yǎng)(2)MSCs的鑒定(3)MSCs的傳代培養(yǎng)(4)不同種植密度對(duì)MSCs生長的影響(5)不同濃度胎牛血清對(duì)MSCs生長的影響(6)傳代細(xì)胞的生長曲線(7)5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs分化為成肌細(xì)胞(8)MSCs受5-Aza-CR誘導(dǎo)后肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)(9)B

3、rdU轉(zhuǎn)染及鑒定(10)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植。
　　結(jié)果：(1)MSCs的分離培養(yǎng)脫頸處死6周齡SD大鼠1只，75％酒精浸泡5min滅菌，取出大鼠雙側(cè)脛骨及股骨，剪去長骨兩端，暴露骨髓腔，5ml注射器反復(fù)沖洗得到單細(xì)胞：懸液，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。根據(jù)MSCs與雜質(zhì)細(xì)胞的貼壁時(shí)間差純化干細(xì)胞，鏡下可見細(xì)胞開始貼壁變形，原代干細(xì)胞呈圓形、三角形、多角形，雜質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈圓形或不貼壁。培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察可見貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，

4、部分呈集落樣生長。培養(yǎng)4～6d后，貼壁細(xì)胞分裂增殖明顯，可見較多的分裂相，隨著細(xì)胞數(shù)目增多，二維生長的干細(xì)胞群內(nèi)空間趨于狹窄，故出現(xiàn)漩渦樣，成纖維樣細(xì)胞集落。(2)MSCs的鑒定對(duì)干細(xì)胞的鑒定仍然是一個(gè)難題，目前尚無統(tǒng)一的、權(quán)威的標(biāo)準(zhǔn)。目前的現(xiàn)狀是，大多數(shù)人采用聯(lián)合應(yīng)用多種抗體分離鑒定MSCs，一般采用排除法或推逆法對(duì)其進(jìn)行鑒定。目前最常用的間充質(zhì)干細(xì)胞陽性標(biāo)記物有：SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD54、CD73、

5、CD105、CD166等；陰勝標(biāo)記物有：CD14、CD34、CD45、CD34、CD31、VWF等，本實(shí)驗(yàn)選擇CD29，CD44作為陽性標(biāo)記物，CD34，CD4.5作為陰性標(biāo)記物，以免疫組化法檢測細(xì)胞特異性抗原。(3)MSCs傳代培養(yǎng)10-14天，細(xì)胞密度逐步增加，融合成片。傳代接種后的細(xì)胞分布均勻，以梭狀為主。傳1、2代的MSCs形態(tài)均一，呈長梭形，雜質(zhì)細(xì)胞隨傳代、換液逐漸減少。培養(yǎng)至傳P8(傳八代)細(xì)胞，干細(xì)胞仍然存活，但細(xì)胞生長緩

6、慢，形態(tài)開始變化，折光性較差，開始脫壁凋亡。(4)不同種植密度對(duì)MSCs生長的影響在106/ml密度接種時(shí)：MTT比色法檢測OD490值最大，活細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞活性較好，較利于MSCs的生長。(5)不同濃度胎牛血清對(duì)MSCs生長的影響在10％～15％的胎牛血清濃度時(shí)MTT比色法檢測OD490最高，證明10％～15％血清濃度最適宜MSCs生長。(6)傳代細(xì)胞的生長曲線細(xì)胞生長曲線呈S形，增殖包括滯留期、對(duì)數(shù)生長期、平臺(tái)期三個(gè)時(shí)期，P1(傳

7、一代)細(xì)胞增殖較快，其速度明顯快于其他時(shí)期。(7)5-Aza-CR誘導(dǎo) MSCs最適濃度測定及誘導(dǎo)效果不同濃度5-Aza-CR誘導(dǎo) MSCs，在10umol/L的濃度時(shí)MTT比色法檢測OD490最高，證明10umol/L5-Aza-CR濃度最適宜MSCs誘導(dǎo)。以10umol/L5-Aza-CR誘導(dǎo)傳 MSCs，4d后未發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞胞體明顯變化，10d見小部分細(xì)胞胞體增大、變長，13d可見部分細(xì)胞相互接觸，至15d-17d可見有類肌管樣結(jié)構(gòu)

8、出現(xiàn)。(8)MSCs受5-Aza-CR誘導(dǎo)后肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)后的細(xì)胞4d檢測，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)肌細(xì)胞特異抗原，誘導(dǎo)后的細(xì)胞12d后，細(xì)胞表達(dá)desmin(結(jié)蛋白)明顯呈陽性，5-Aza-CR誘導(dǎo)后14d表達(dá)myosin(肌動(dòng)蛋白重鏈)程度明顯呈陽性。(9)BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定在傳3代干細(xì)胞中加入含BrdU40μ g/ml標(biāo)記培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h，觀察可見細(xì)胞生長良好，懸浮死亡細(xì)胞較少，進(jìn)一步鋪片以免疫組化法檢測轉(zhuǎn)染情況，可見部分細(xì)胞核

9、呈棕黃色，說明轉(zhuǎn)染成功。(10)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植將誘導(dǎo)后的干細(xì)胞用 BrdU標(biāo)定，手術(shù)直視下移植入大鼠膀胱內(nèi)，4周后取出大鼠膀胱，以免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞在活體大鼠膀胱內(nèi)可繼續(xù)生存且分布均勻。
　　結(jié)論：(1)骨髓提取培養(yǎng)后得到的不是單一種類細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞只占其中一小部分，需要人為施加影響因素，使其擴(kuò)增，純化，最終形成以干細(xì)胞為主的細(xì)胞群落。(2)MSCs生長先慢后快再慢，呈典型的S型曲線，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)P

10、4以內(nèi)的MSCs適應(yīng)能力強(qiáng)，形態(tài)穩(wěn)定，代謝旺盛，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。(3)初次換液最佳時(shí)間為2-4小時(shí)，視具體情況而定，換液間隔一般為3-5天，傳代時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活掌握。(4)最適合MSCs生長的環(huán)境為含10％胎牛血清和90％DMEM(L)的培養(yǎng)液，最適合MSCs向成肌細(xì)胞分化的環(huán)境為10％馬血清、90％DMEM(L)和10μmol/L5-Aza-CR構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。(5)誘導(dǎo)后干細(xì)胞desmin(結(jié)蛋白)、myosin(肌動(dòng)

11、蛋白重鏈)均呈陽性表達(dá)，說明5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs向成肌細(xì)胞分化成功。(6)經(jīng)鑒定，本實(shí)驗(yàn)提取的干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記抗原CD29，CD414呈陽性表達(dá)，CD34，CD415呈陰性表達(dá)，說明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)體系中的主要細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，純度高，活性大，可以用于實(shí)驗(yàn)研究。(7)經(jīng)檢測，SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在移植入膀胱逼尿肌無力模型鼠后，可繼續(xù)存活于大鼠膀胱肌層內(nèi)，移植后連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)鼠3個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)：SD大鼠骨髓間