小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：了解成年小鼠骨髓中是否存在具有向胰胰島細(xì)胞分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，探索小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化及體外擴(kuò)增的方法，了解其可能的分化機(jī)制，探討在體內(nèi)移植條件下，高血糖及尼克酰胺、β-巰基乙醇對(duì)其向胰胰島細(xì)胞定向分化的影響。 方法：選擇6-10周齡BALB/C雄性小鼠，頸椎脫臼法處死，分離出雙側(cè)股及脛骨。用DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，經(jīng)過濾、吹打制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)差速貼壁法培養(yǎng)擴(kuò)增，得到量多且相對(duì)較純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)

2、行體外培養(yǎng)的觀測(cè)及HE染色及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。切除BALB/C雌性小鼠＞80％的胰腺[1]，并輔以25％的糖水喂養(yǎng)，制造出穩(wěn)定的高血糖模型。在切除胰腺的同時(shí)將實(shí)驗(yàn)組分兩組：A組，注入分離擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，注入部位為肝臟左葉及左后肢肌肉(N=20)，再細(xì)分為兩組：A1(N=10)組腹腔注入生理鹽水；A2(N=10)組腹腔注入誘導(dǎo)劑(尼克酰胺、β-巰基乙醇)；B組肝臟及肌肉注入DMEM為B(N=10)，腹腔注入誘導(dǎo)劑(尼克酰胺、β-巰

3、基乙醇)；C正常對(duì)照組(N=10)。取不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)小鼠血糖；移植術(shù)后6周對(duì)各組小鼠作糖耐量試驗(yàn)；移植術(shù)后7周取材[2]，進(jìn)行胰島素免疫組化染色分析。通過比較分析，判斷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)向胰胰島細(xì)胞的分化潛能，及尼克酰胺、β-巰基乙醇對(duì)分化的影響。 結(jié)果：用差速貼壁法進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)和分離，經(jīng)鑒定獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到一定的數(shù)量及純度，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在高血糖模型小鼠體內(nèi)植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后4周，A1組平均空腹血糖為

4、8.57±1.85mmol/L，A2組平均空腹血糖為8.67±2.08mmol/L,B組(注射DMEM組)平均空腹血糖為8.37±2.01mmol/L，C組(正常對(duì)照2組)平均空腹血糖為4.79±0.72mmol/L。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)A1、A2、B組的血糖與C組仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。各小鼠組術(shù)后24H血糖升高明顯，72H后趨于平穩(wěn)。在糖耐量試驗(yàn)中，給糖前、給糖后30、60、180min，A1、A2、B組的血糖均高于C組(P＜0.0

5、1)，A1、A2組與B組間各時(shí)間點(diǎn)的血糖無明顯差異(P＞0.05)。各組移植物作冰凍切片HE染色和免疫組化檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)成熟胰島樣結(jié)構(gòu)，但在A1、A2組植入的肝標(biāo)本中可見胰島素染色陽性細(xì)胞，A1組平均陽性細(xì)胞數(shù)為2.76±0.73個(gè)/視野(高倍x400)，A2組平均陽性細(xì)胞數(shù)為4.19±0.58個(gè)/視野(高倍x400)，兩組比較A2組多于1A組(P＜0.05)，B、C組的肝標(biāo)本中均未見陽性細(xì)胞。各組肌肉標(biāo)本中均未能發(fā)現(xiàn)胰島素染色陽性細(xì)胞

6、。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)使用差速貼壁法可獲得一定純度的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，個(gè)人認(rèn)為這種方法簡(jiǎn)單、便捷、實(shí)用，而且這種方法所獲得的細(xì)胞狀態(tài)良好，體外條件下能增殖，原代及傳1代生長(zhǎng)都可形成均一的細(xì)胞集落。接受骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的小鼠與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組在血糖濃度和糖耐量試驗(yàn)中均無顯著差異，沒有改善胰腺大部分切除后血糖、及糖耐量狀況；但在肝臟移植部位取材標(biāo)本免疫組化染色中可見小量的胰島素染色陽性細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：1)差速貼壁培養(yǎng)法能有效地分離