MicroRNA-133誘導綿羊間充質(zhì)干細胞分化為成肌細胞的研究.pdf

1、已有研究證實，miR-133在肌肉發(fā)育中起到非常重要的作用。間充質(zhì)干細胞是具有自我更新和多向分化潛能的細胞。為了探明利用miR-133誘導綿羊臍帶和骨髓間充質(zhì)干細胞為成肌細胞的方法，本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將肌肉特異表達的miR-133轉(zhuǎn)染到綿羊臍帶、骨髓間充質(zhì)干細胞后，檢測其誘導為成肌細胞的能力。其研究結(jié)果如下：
　　1.綿羊臍帶、骨髓間充質(zhì)干細胞的轉(zhuǎn)染
　　采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將-miR-133a2表達載體或miR-13

2、3mimics分別轉(zhuǎn)染綿羊臍帶間充質(zhì)和骨髓間充質(zhì)干細胞;
　　2.轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)與形態(tài)觀察
　　將上述轉(zhuǎn)染細胞進行續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)的第28d，在倒置熒光顯微鏡下細胞呈現(xiàn)梭形或紡錘形;當細胞約達到80％匯合時，細胞由渦旋狀生長變成定向有序的排列生長，并且鄰近細胞間出現(xiàn)融合傾向;
　　3.轉(zhuǎn)染細胞的鑒定
　　(1)成肌細胞特異表達基因的qRT-PCR檢測采用qRT-PCR方法檢測上述細胞骨骼肌特異基因MyoD、MyoG、D

3、esmin、Tnni2、Myf5表達情況。在轉(zhuǎn)染前未檢測到MyoD和MyoG表達，轉(zhuǎn)染后可以檢測到MyoD和MyoG的表達; Desmin、Tnni2、Myf5在轉(zhuǎn)染后相對表達量增加。此外，與綿羊骨髓間充質(zhì)干細胞相比，綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞在誘導后Desmin、Tnni2、Myf5相對表達量增加更多;
　　(2)成肌細胞特異表達基因的免疫熒光檢測利用MyoD、Desmin和α-actin相應抗體對轉(zhuǎn)染細胞進行免疫熒光檢測，其結(jié)果，與

4、對照組（未轉(zhuǎn)染細胞）在鏡下未檢測到相應基因發(fā)出熒光相比，4組轉(zhuǎn)染細胞中，MyoD和Desmin蛋白檢測結(jié)果均呈現(xiàn)陽性，而α-actin呈現(xiàn)陰性;
　　(3)成肌細胞特異表達基因的流式細胞檢測當將pcDNA3.1-miR-133a2表達載體分別轉(zhuǎn)染綿羊臍帶和骨髓間充質(zhì)干細胞后，采用流式細胞分析技術(shù)檢測成肌細胞特異蛋白MyoD、Desmin和α-actin，其結(jié)果，在綿羊臍帶、骨髓間充質(zhì)干細胞中，表達MyoD的細胞量分別為12.2％和

5、29.6％，表達Desmin的細胞量分別為99.3％和99.5％，表達α-actin的細胞量分別為0.917％和9.24％;當將miR-133mimics分別轉(zhuǎn)染綿羊臍帶和骨髓間充質(zhì)干細胞后，在這些細胞中檢測到表達MyoD的細胞量分別為99.3％和43.7％，表達Desmin的細胞量分別為99.0％和100％，表達α-actin的細胞量分別為1.07％和1.68％;
　　上述結(jié)果表明，利用miR-133成功誘導綿羊臍帶間充質(zhì)干細胞