HIF-1在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用及脯氨酰羥化酶siRNA對其表達(dá)的影響.pdf

1、目的：利用小干擾RNA干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）的生成，探討其對在模擬心肌缺血再灌注損傷時(shí)在缺氧/復(fù)氧（hypo xia-reoxygenation，H/R）損傷方面對心肌細(xì)胞功能的修復(fù)，以及HIF－1α的變化對下游靶基因水平的影響，在臨床治療和預(yù)防患者的心肌梗死患方面提供心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的治療新思路。
　　方法：（1）取1-2天的SD乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，雌雄隨機(jī)，對分離純化的心肌細(xì)

2、胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)方面的觀察和鑒定，選取介入模擬缺氧復(fù)氧條件時(shí)細(xì)胞自發(fā)生長的最佳時(shí)間，設(shè)計(jì)并構(gòu)建乳鼠的心肌細(xì)胞體外缺氧/復(fù)氧（H/R）模型
　?。?）設(shè)計(jì)并建立缺氧復(fù)氧模型，將分離純化后已培養(yǎng)第3至4天的SD乳鼠原代心肌細(xì)胞等量隨機(jī)分成3組，具體分組方式為：
　?、僬φ战M（質(zhì)量控制及對照Control組）；
　　②缺氧/復(fù)氧（H/R）組；
　　③siRNA轉(zhuǎn)染后的乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（P4HA2·siRNA H/

3、R）組；
　?。?）缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建完成后，將培養(yǎng)好的各組心肌細(xì)胞分別置于倒置顯微鏡下，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的觀察和計(jì)數(shù)，包括計(jì)數(shù)各分組細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、存活率以及各分組心肌細(xì)胞在形態(tài)學(xué)方面的變化；檢測心肌細(xì)胞的增殖情況，形態(tài)改變情況以及存活率變化（MTS法）；
　?。?）構(gòu)建并鑒定P4HA2小干擾RNA（siRNA），制備慢病毒載體，轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞；
　?。?）采用SYBR Green熒光定量PCR法擴(kuò)增，檢測HIF-

4、1α在各組心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中的表達(dá)水平；用化學(xué)發(fā)光法檢測各組心肌細(xì)胞的特異性損傷指標(biāo)肌鈣蛋白I（cTnI）的含量；采用SYBR Green熒光定量PCR法檢測下游靶基因VEGF、GLUT-1和HO-1mRNA表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0軟件，采用One-Way ANOVA分析比較組間數(shù)據(jù)，兩兩比較方差分析采用LSD方法。
　　結(jié)果：（1）接種四到六個(gè)小時(shí)左右后心肌細(xì)胞開始貼壁生長，約十五到二十四小時(shí)后貼壁的心肌細(xì)胞開

5、始多呈梭形、菱形及多角形，并出現(xiàn)節(jié)律性自發(fā)性的搏動(dòng)
　?。?）在倒置顯微鏡下觀察到的新鮮分離的大鼠心肌細(xì)胞呈球形，四到八小時(shí)后心肌細(xì)胞開始貼壁生長融合，呈不規(guī)則橢圓形和梭形，三十二小時(shí)左右大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)為放射狀排列的細(xì)胞簇，胞漿逐漸豐富，細(xì)胞核變大，七十二小時(shí)后心肌細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，并伸出偽足，逐漸連接成網(wǎng)狀交織的細(xì)胞單層，折光性增強(qiáng)并出現(xiàn)同步化搏動(dòng)，收縮頻率穩(wěn)定且有力，至第4天搏動(dòng)達(dá)高峰，搏動(dòng)頻率為90～120/min，第五第六

6、天此狀態(tài)在穩(wěn)定培養(yǎng)條件下可保持，從第7天起原代細(xì)胞開始逐漸衰亡，搏動(dòng)頻率逐漸減少且頻率不穩(wěn)定，此后細(xì)胞開始逐漸皺縮，胞漿出現(xiàn)粗大顆粒和空泡，證明細(xì)胞衰亡。
　?。?）H/R模型成功建立
　?。?）構(gòu)建并鑒定P4HA2小干擾RNA，確定siRNA的有效靶點(diǎn)，制備慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳鼠原代心肌細(xì)胞，建立轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞H/R模型
　?。?）①關(guān)于各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率及存活率的兩兩比較：
　　H/R組與正常control

7、組比較明顯降低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞H/R組與正常control組比較明顯升高，H/R組與轉(zhuǎn)染細(xì)胞H/R組相比明顯降低（P<0.05）；
　?、陉P(guān)于各組細(xì)胞肌鈣蛋白I的含量的兩兩比較：
　　H/R組與正常control組比較明顯升高，轉(zhuǎn)染細(xì)胞H/R組與正常control組比較明顯降低，H/R組與轉(zhuǎn)染細(xì)胞H/R組相比明顯升高（P<0.05）；
　?、坳P(guān)于各組心肌細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、

8、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（GLUT-1）以及血紅素氧合酶-1（HO-1）mRNA的表達(dá)水平兩兩比較：
　　H/R組與正常control組比較明顯降低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞H/R組與正常control組比較明顯升高，H/R組與轉(zhuǎn)染細(xì)胞H/R組相比明顯降低（P<0.05）
　　結(jié)論：HIF-1α因子通過調(diào)節(jié)下游靶基因，可以達(dá)到保護(hù)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞的作用；心肌細(xì)胞中HIF-1α的含量在利用P4HA2·siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，可以在未出現(xiàn)缺氧