FAM40A的足細胞定位及其對細胞骨架的影響.pdf

1、足細胞即腎小球臟層上皮細胞，它連同腎小球基膜(GBM)、有窗孔的腎小球內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞表面蛋白多糖和足細胞下區(qū)共同構(gòu)成腎小球濾過屏障。越來越多的研究證明足細胞在腎臟疾病的發(fā)展中有重要地位。
　　 足細胞病是指腎臟腎小球單位中的足細胞出現(xiàn)異常而導致的一類疾病，是出現(xiàn)蛋白尿的重要原因。2002年Pollak首次使用“足細胞病(podocytopathies)”這一名詞，將患者存在腎小球足細胞數(shù)量和（或）密度減少、基底膜增厚、腎小球

2、基質(zhì)成分改變以及足突融合為特征的腎小球疾病稱為足細胞病。經(jīng)典的足細胞病包括微小病變性腎病和局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥。
　　 局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(focal and segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是以局灶節(jié)段分布的腎小球硬化及足細胞變性所致足突融合或消失為主要病理特征的原發(fā)性腎小球疾病。臨床表現(xiàn)為中到大量蛋白尿、浮腫、高血壓和腎功能不全等，有相當數(shù)量的患者對激素和免疫抑制劑等藥物治療不敏

3、感，腎功能呈進行性惡化，最終進展至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)。國外報告成人腎活檢病例中，F(xiàn)SGS占腎小球疾病的15-20％，在黑人中甚至高達64％;國內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)SGS約占腎活檢中原發(fā)性腎小球疾病的6％。近年來的數(shù)據(jù)顯示FSGS發(fā)病呈逐年增高的趨勢，對其發(fā)病機制及治療的研究也一直是當今的熱點。
　　 FSGS根據(jù)病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性和家族性/遺傳性三類。家族性局灶節(jié)段腎小球硬化癥

4、（Familial focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)FSGS）可以視為FSGS的特有類型，由于受人口學的影響及診斷措施的局限性臨床確診困難，實際的發(fā)病率并不低，據(jù)國外報道18％的FSGS是與基因突變、家族性遺傳背景有關。
　　 近二十年，人們基于對家族性FSGS的研究，發(fā)現(xiàn)了許多在足細胞和其之間的裂孔隔膜上表達的突變蛋白，這些功能蛋白絕大多數(shù)對足細胞骨架以及裂孔隔膜的完整性的保持都是非常重

5、要的。FSGS作為一種典型的足細胞病變，其損傷可以發(fā)生在多個環(huán)節(jié)上，包括細胞骨架(cytoskeleton)的破壞、細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的異常、胞漿內(nèi)線粒體能量產(chǎn)物異常、細胞內(nèi)鈣離子動態(tài)穩(wěn)定性的改變及裂孔隔膜上其他成分的異常等，其中足細胞骨架結(jié)構(gòu)的變化對足細胞的功能影響最大。細胞骨架是真核細胞維持生命活動的重要組成成分，包括微絲、微管和中間絲。其中，微絲是由肌動蛋白(actin)、肌動蛋白結(jié)合蛋白以及肌球蛋白(myosin)三者構(gòu)成。在足細

6、胞中，微絲結(jié)構(gòu)是以肌動蛋白為基礎，并與α-actinin-4、Synaptopodin和肌球蛋白等共同組成具有精細調(diào)節(jié)和收縮作用的足細胞肌動蛋白微絲骨架。
　　 我們研究小組多年致力于家族性FSGS大家系的遺傳學研究，前期我們發(fā)現(xiàn)一5代54名成員的家族性FSGS家系，通過連鎖分析和全外顯子測序及進一步家系內(nèi)過濾篩查，已初步確定其致病基因為FAM40A，并以此為基礎成功申請到兩個國家自然基金（面上項目）的連續(xù)支持。
　　

7、對FAM40A的序列研究和生物信息學分析發(fā)現(xiàn):其有21個外顯子，其編碼蛋白有837個氨基酸，預測其含有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，并且可以與DNA結(jié)合，推測其為一種三次跨核膜的蛋白。其N基端富含脯氨酸，我們推測其可以與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白直接相結(jié)合而發(fā)揮特定的功能。FAM40A又被稱為STRIP1(striatin interactingprotein1).其可以編碼STRIPAK(striatin-interacting phosphatase

8、 and kinase)復合體的一種核心蛋白。而最新的有關FAM40A的研究證明:FAM40A在調(diào)節(jié)細胞骨架動態(tài)變化、細胞形態(tài)和細胞的伸展(spreading)中發(fā)揮重要作用。該基因表達水平的改變會影響到細胞形狀、肌動蛋白絲的分布和細胞遷移。
　　 我們的預實驗發(fā)現(xiàn):應用免疫組化(IHC)染色的方法，可見FAM40A在正常的大鼠腎小球足細胞、壁層上皮細胞和集合管細胞均有上有表達;并初步在同為典型足細胞病變且極易進展為FSGS的膜

9、性腎病(MCD)大鼠模型(PHN)和微小病變性腎病(MCD)大鼠模型(PAN)，對FAM40A的表達進行了觀察。
　　 據(jù)此本課題擬通過體外培養(yǎng)永生化的小鼠足細胞，結(jié)合之前我們對FAM40A的生物信息學分析，觀察其在小鼠足細胞上的表達和定位，明確FAM40A的亞細胞定位;其次應用siRNA沉默技術，構(gòu)建FAM40A沉默的足細胞模型，觀察其沉默后對足細胞細胞骨架的影響，確定其是否與細胞骨架相關。結(jié)果顯示:FAM40A在小鼠的腎臟足

10、細胞上有表達，其表達定位主要在細胞核內(nèi)和核周圍的胞漿中。與對照組相比，在FAM40A蛋白被沉默的足細胞模型中，F(xiàn)-actin的分布發(fā)生了明顯的變化，其主要向細胞的外圍四周分布增加，而胞漿的中央?yún)^(qū)域分布明顯減少;并且，在分化成熟的足細胞中同時伴有細胞突起的明顯減少等細胞形態(tài)的改變。而對微管蛋白α-tubulin、以及完全分化成熟的足細胞形態(tài)和細胞周期影響不大。
　　 此部分實驗證實FAM40A的缺失會對細胞骨架F-actin的分布