膜-細(xì)胞骨架聯(lián)接分子ezrin對肝細(xì)胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、後旦大學(xué)學(xué)校代碼：10246學(xué)號：031104131博士學(xué)位論文膜一細(xì)胞骨架聯(lián)接分I“ezrin對肝細(xì)胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移的影響院專姓系：業(yè)：名：中山醫(yī)院腫瘤學(xué)張巖指導(dǎo)教師：割康達(dá)教授中文摘要的影響。方法：選取4株肝癌細(xì)胞系(SF／SMMC7721、MHCC97一H、MHCC一1和HepG2)作為研究對象，針對ezrin基因設(shè)計小干擾RNA(SmallinterferingRNA，siRNA)并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。分別通過熒光實(shí)時定量聚合

2、酶鏈反應(yīng)(RealtimePCR)和Western印跡驗(yàn)證siRNA對ezrin在基因和蛋白水平的下調(diào)及下調(diào)作用隨轉(zhuǎn)染時間的變化。根據(jù)Western印跡的結(jié)果選取ezrin蛋白表達(dá)最低的時間點(diǎn)檢測干擾后肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。運(yùn)用四甲基偶氮唑蘭(MTT)法檢測肝癌細(xì)胞增殖能力的變化；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；電子顯微鏡觀察細(xì)胞偽足的形態(tài)和數(shù)量改變；transwell實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞運(yùn)動和侵襲能力的變化。結(jié)果：熒光實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)和W

3、estern印跡顯示ezrinsiRNA對ezrin在基因和蛋白水平均有顯著的下調(diào)作用。下調(diào)ezrin蛋白可顯著減慢4株肝癌細(xì)胞的生長速度(PO05)，處于分裂期的肝癌細(xì)胞比例明顯下降。腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動侵襲能力下降，細(xì)胞偽足變短，且偽足的形成數(shù)量顯著減少(sF／s刪c772l：20830個／細(xì)胞與13224個／細(xì)胞，PO05：MttCC97一H：18427個／細(xì)胞與14029個／細(xì)胞，尺O01；姍C(jī)c一1：22635個／細(xì)胞與13319個

4、／細(xì)胞，尺O01：HepG2：31029個／細(xì)胞與17823個／細(xì)胞，PO01)。穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量也明顯減少(SF／s硎c7721：49977個與319452個，只O05：MHCC97一H：58542個與33O33個，只O01；MHCC一1：57661個與28334個，尺OOl；HepG2：37330個與25323個，尸O01)。結(jié)論：ezrin在肝癌生長和侵襲轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮重要的作用，有可能成為抑制肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子。三ez

5、rin對肝癌生長和轉(zhuǎn)移影響的體內(nèi)研究目的：選取高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系MHCC一97H為研究對象，通過裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證ezrin對肝癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。方法：通過轉(zhuǎn)染入細(xì)胞持續(xù)表達(dá)ezrinsiRNA的質(zhì)粒，篩選出一株ezrin下調(diào)穩(wěn)定株。體外鑒定其生長和運(yùn)動侵襲能力后，進(jìn)行裸鼠皮下接種實(shí)驗(yàn)，通過繪制腫瘤生長曲線和比較ezrin下調(diào)前后腫瘤的淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移率來評估ezrin對肝癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的姍C(jī)c一97H經(jīng)過G

6、418篩選后，選取ezrin抑制率最高的命名為97Hezrin(L)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示97Hezrin(L)的惡性增殖能力和運(yùn)動侵襲能力均明顯下降(po01)。裸鼠皮下接種腫瘤后2周成瘤，97Hczrin(L)的生長速度明顯慢于MHCC97H，到6周處死時MHCC97II成瘤的重量是97Hezrin(L)的15倍。腫瘤病理切片顯示實(shí)驗(yàn)組97Hezrin(L)腫瘤細(xì)胞的分裂相及病理分裂相較數(shù)量較對照組明顯減少。肺和淋巴結(jié)的病理切片顯示97