P18蛋白的亞細(xì)胞定位及其對細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的影響.pdf

1、腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多步驟、多基因參與的過程。尋找參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因并深入研究這些基因在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用，對于闡明癌癥的發(fā)病機(jī)制以及診斷、預(yù)防和治療均具有重要意義。我們實(shí)驗(yàn)室為探討肺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，在人肺癌細(xì)胞中獲得了一個(gè)新的功能基因，將其命名為p18(原名GB14)。本文我們將已構(gòu)建的p18真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到人肺癌細(xì)胞AGZY83-a和小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3中，對P18蛋白的亞細(xì)胞定位及其功能作

2、用做了進(jìn)一步的研究。
　　運(yùn)用免疫電鏡技術(shù)對AGZY83-a細(xì)胞中的P18蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)P18蛋白在細(xì)胞核中具有明顯的標(biāo)記信號，在胞漿中主要是在線粒體中有金顆粒存在。
　　根據(jù)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果，我們采用FITC-鬼筆環(huán)肽對F-actin染色，通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果顯示，NIH3T3-p18細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的改變：微絲減少，細(xì)胞間通訊連接消失或降低，細(xì)胞膜邊緣卷翹、皺

3、縮，微絲主要聚集在細(xì)胞邊緣。說明該基因的表達(dá)影響了微絲的組裝情況。應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)對細(xì)胞骨架的另一組成成分-微管的分析表明，微管在形態(tài)學(xué)上沒有明顯改變。根據(jù)微絲變化的形態(tài)學(xué)特征，我們進(jìn)一步對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p18的小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3進(jìn)行研究，通過應(yīng)用半定量RT-PCR、western-blot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分析轉(zhuǎn)染前后NIH3T3細(xì)胞中的紐蛋白（vinculin）和連接蛋白（connexin43,Cx43）的表達(dá)情況。結(jié)果表