大豆7S致敏蛋白‘α-亞基缺失型’近等基因系的近等性評價與應(yīng)用.pdf

1、7S球蛋白是大豆種子貯藏蛋白的重要組分也是主要的致敏原。其亞基缺失突變體可以在去除致敏蛋白的同時改善大豆蛋白的營養(yǎng)及加工品質(zhì)。目前α亞基缺失的等位變異對種子蛋白營養(yǎng)及加工品質(zhì)的作用及貢獻大小尚無充分研究，其分子機制尚未解析。
　　近等基因系(NILs)是理論上可以最大限度排除遺傳背景干擾，使單基因效應(yīng)得以充分表達的理想遺傳學材料。本研究首先利用父母本間307個均勻分布于大豆20個連鎖群的SSR差異引物對‘α-亞基缺失型’近等基因系

2、候選群體進行全基因組遺傳背景掃描，2014年底完成了近等基因系預(yù)備群體全面、系統(tǒng)的分子水平的近等性評價，綜合嚴謹、系統(tǒng)的形態(tài)相似性評價，完成了一對以中國高油大豆‘東農(nóng)47’為遺傳背景的‘致敏蛋白α-亞基缺失型’單基因近等基因系‘cgy-2-NIL’的創(chuàng)制?！甤gy-2-NIL’的創(chuàng)制，為α-亞基缺失優(yōu)異等位基因分子水平上的遺傳學研究、及其在低致敏大豆分子育種中的應(yīng)用提供了理想的、永久性遺傳學材料平臺。
　　目前，α-亞基缺失的等位

3、變異對種子蛋白品質(zhì)的具體影響及其對缺失體品質(zhì)改良貢獻的大小尚無定論，其分子機制尚未解析。本研究以α單亞基缺失型近等基因系‘cgy-2-NIL’為材料，通過對‘cgy-2-NIL’及其輪回親本‘東農(nóng)47’進行氨基酸組分、及豆腐加工特性的測定分析，研究α缺失等位基因cgy-2對大豆蛋白營養(yǎng)及豆腐加工品質(zhì)各項指標的影響及貢獻率，以期明確α-亞基缺失等位基因的遺傳學效應(yīng)。
　　RNA-Seq是最近發(fā)展起來的利用深度測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析的

4、技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于大豆種子發(fā)育轉(zhuǎn)錄水平的研究。大豆種子發(fā)育過程中貯藏蛋白的合成主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄組水平基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)的獲得是透徹解析大豆致敏蛋白亞基缺失突變體遺傳機制必不可少的任務(wù)之一，為了進一步尋找與α-缺失突變體相關(guān)的關(guān)鍵基因，本研究采用RNA-Seq技術(shù)，利用α-亞基缺失型近等基因系‘cgy-2-NIL’對α-缺失突變體進行五個發(fā)育時期（花后18、25、35、50、和55天）轉(zhuǎn)錄組差異比較。具體結(jié)果如下:
　　(1)

5、經(jīng)過4代回交，綜合SSR標記全基因組遺傳背景掃描及嚴格的形態(tài)相似性評價，本研究成功創(chuàng)制了以中國高油大豆‘東農(nóng)47’為遺傳背景的α-亞基缺失型近等基因系(NIL)，將其命名為‘cgy-2-NIL’?！甤gy-2-NIL’僅在第20號染色體上存在α-亞基缺失基因cgy-2的單一導入片段、其綜合農(nóng)藝性狀各個指標與其輪回親本‘東農(nóng)47’基本一致，利用該近等基因系可以最大限度的降低遺傳背景的干擾、精準的分析α-缺失基因的遺傳效應(yīng)、是α-亞基缺失基

6、因精細定位，圖位克隆及相關(guān)基因功能驗證研究理想的遺傳學材料平臺。
　　(2)近等基因系‘cgy-2-NIL’的粗蛋白含量，氨基酸總量，必須氨基酸總量，含硫氨基酸含量（蛋氨酸+半胱氨酸）分別比輪回親本‘東農(nóng)47’高出4.11，4.16，5.20和11.96個百分點。‘cgy-2-NIL’中必須氨基酸組分:蘇氨酸(Thr)，纈氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，異亮氨酸(Ile)含量的顯著增加導致其必須氨基酸總量明顯高于對照‘東農(nóng)47’

7、?！甤gy-2-NIL’蛋氨酸含量的顯著增加是導致其含硫氨基酸總量(Met+Cys)顯著高于‘東農(nóng)47’的主要原因。
　　(3)成熟種子‘cgy-2-NIL’游離精氨酸的含量是‘東農(nóng)47’的兩倍。‘cgy-2-NIL’中，游離精氨酸含量占其游離氨基酸總量的36.81％，游離天門冬氨酸(Free Asp)和游離谷氨酸(Free Glu)分別占11.63％和9.32％，其余的游離氨基酸組分占‘cgy-2-NIL’游離氨基酸總量的42.

8、24％。游離精氨酸含量的大幅增加是‘cgy-2-NIL’游離氨基酸總量顯著高于對照‘東農(nóng)47’的主要原因。
　　(4)近等基因系‘cgy-2-NIL’TEAA及EAAI的得分都顯著高于‘東農(nóng)47’。可見，致敏蛋白α亞基缺失，在降低致敏率的同時，可以提高氨基酸總量，改善氨基酸品質(zhì)。
　　(5)通過RNA-Seq測序，在‘cgy-2-NIL’與‘東農(nóng)47’兩材料間，共檢測到20，295個表達有顯著差異的基因。其中花后18、25、

9、35、50及55天時，‘cgy-2-NIL’與‘東農(nóng)47’間表達有顯著差異的基因數(shù)分別是174、151、123、158和2837個。本研究所檢測到的差異基因幾乎都具有發(fā)育時期差異表達特異性，在花后55天時二者間顯著差異表達的基因數(shù)目最多，只有17個基因在五個發(fā)育時期內(nèi)全部差異表達;‘顯著差異表達排名前20的基因’主要集中在花后18天及花后55天，花后18天差異表達的基因，可以認定為是決定α-缺失特性的關(guān)鍵基因，開花后55天差異表達的各個

10、基因，則可以認定為是突變體應(yīng)對蛋白組分改變、保持蛋白品質(zhì)的關(guān)鍵基因。
　　(6) Gene Ontology(GO)分析結(jié)果表明，花后18、35、55天差異基因GO分類的結(jié)果大體類似，但花后25及50天時差異基因GO富集的分類特點截然不同。在18、25、35、50和55天，‘cgy-2-NIL’與‘東農(nóng)47’之間分別鑒定出16條、3條、9條、4條和12條pathway。特別值得關(guān)注的是花后18天時，檢測到多個差異表達基因被富集在氨

11、基酸代謝途徑及脂肪酸代謝途徑中。
　　(7)五個發(fā)育期，共鑒定到74個轉(zhuǎn)錄因子基因在α-亞基缺失突變體‘cgy-2-NIL’內(nèi)發(fā)生差異表達，其中GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族中的差異表達基因數(shù)目最多。多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因在花后55天時差異表達，花后50天時檢測到的差異表達的轉(zhuǎn)錄因子最少。13個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在花后55天時全部下調(diào)表達。
　　(8)‘cgy-2-NIL’中，有18個差異表達基因被注釋為編碼Cupin過敏蛋白，α-亞

12、基缺失導致突變體內(nèi)幾乎所有7S球蛋白亞基（α'、α、β-亞基）與11S球蛋白亞基(Gy1-、Gy2-、Gy3-、Gy4-、Gy5-亞基)基因在多數(shù)發(fā)育期內(nèi)均呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢。G1YMA20G28660（即α-亞基基因）是所有差異表達基因中，在花后25、35、和50天時均顯著下調(diào)表達的基因，α-亞基缺失突變體‘cgy-2-NIL’11S球蛋白Gy3與Gy7亞基基因的表達模式與Gy1-Gy5亞基不同。突變體‘cgy-2-NIL’內(nèi)7S與11