PGF2α-FP受體與糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化的研究.pdf

1、論文Ⅰ:PFG2α通過FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原獨(dú)立于TGF-β1
　　背景：
　　糖尿病心肌病(DiabeticCardiomyopathy,DCM)是導(dǎo)致糖尿病病人罹難率升高的重要原因，迄今為止依然是人類心臟疾病中危險(xiǎn)性最大的疾病之一。其作為一種獨(dú)立并且特異性的心肌病變受到越來越多的關(guān)注。DCM的病理變化復(fù)雜多端，涉及到許多領(lǐng)域，其中主要涉及到心肌細(xì)胞和心肌間質(zhì)兩個(gè)領(lǐng)域。對(duì)于DCM的研

2、究是一個(gè)逐漸演變的過程，在過去幾十年的的研究中，研究領(lǐng)域重點(diǎn)主要放在心肌細(xì)胞的變化上，比如心肌細(xì)胞的肥大、凋亡和壞死;最近幾年來，越來越多的學(xué)者把研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到以前涉足較少的領(lǐng)域上來-心肌間質(zhì)上來。許多研究發(fā)現(xiàn)，心肌間質(zhì)領(lǐng)域——心肌間質(zhì)纖維化在DCM的發(fā)生和發(fā)展中起著舉足輕重的作用。研究心肌間質(zhì)纖維化的病理生理過程以及影響機(jī)制或許成為攻克糖尿病心肌病的一個(gè)新的研究靶點(diǎn)。
　　心肌間質(zhì)纖維化指的是心肌組織成纖維細(xì)胞（cardiac

3、fibroblasts）過度增生從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)大量沉積而形成的病理演變。心臟正常的成年人處在健康平衡生理狀態(tài)下，心肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞分泌和產(chǎn)生的膠原，是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程。ECM主要成分包括膠原Ⅰ和膠原Ⅲ。生理學(xué)角度上來說，ECM的作用是作為“腳手架蛋白”從而把心肌、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管聯(lián)系起來的橋梁，促使形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)而使心肌產(chǎn)生抗張強(qiáng)度，這也就使得心肌產(chǎn)生了收縮和舒張功能。當(dāng)處

4、于病理狀態(tài)下，比如氧化應(yīng)激，高糖狀態(tài)下，由于成纖維細(xì)胞受到外界的不適刺激，產(chǎn)生和分泌的膠原打破了動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致ECM的過量累積。ECM的過量沉積會(huì)導(dǎo)致心臟壁松弛性的降低和僵硬度的升高，這將首先影響到心肌的舒張功能，進(jìn)一步將會(huì)出現(xiàn)類似于限制性心肌病的改變。在病理情況下，過度累計(jì)的ECM在臨床上的主要表現(xiàn)為:早期發(fā)生舒張功能的障礙，晚期發(fā)生收縮功能的障礙。
　　詳細(xì)說來，在心臟中，包括心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞。非心肌細(xì)胞主要是心肌成纖維細(xì)

5、胞，約占細(xì)胞總數(shù)的60％-70％。心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的Ⅰ型、Ⅲ型膠原是最重要的細(xì)胞外基質(zhì)?，F(xiàn)已證實(shí)，給予心肌成纖維細(xì)胞高糖刺激可以引起膠原Ⅰ/Ⅲ分泌增加。但是，在體外模擬糖尿病狀態(tài)下，引起心肌成纖維細(xì)胞膠原沉積的分子機(jī)制仍所知甚少。所以研究心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原的分子機(jī)制是迫在眉睫的問題。
　　胰島素抵抗(insulinresistance，IR)在DCM的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，許多研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗所引起的高糖血癥和

6、高胰島素血癥與纖維化密切相關(guān)。胰島素和其受體胰島素受體結(jié)合后的信號(hào)傳導(dǎo)通路包括兩條:其中一條是胰島素底物受體(InsulinReceptorSubtract-IRS/phosphatidylinositol3-kinase-PI3K/proteinkinaseB(Akt/PKB)信號(hào)通路，主要是影響糖脂代謝和蛋白質(zhì)合成，這一信號(hào)通路稱為代謝信號(hào)通路;另外一條信號(hào)通路是(mitogen-activatedproteinkinase-MAP

7、K(促分裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路途徑，主要參與對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄過程和細(xì)胞的增殖過程的調(diào)控，稱為生長信號(hào)通路。在胰島素抵抗時(shí)，IRS/PI3K/Akt信號(hào)通路途徑出現(xiàn)明顯的受損[11]，而MAPK途徑功能仍舊保持其正常[12]，或許出現(xiàn)功能增強(qiáng)，這就是我們所謂的“選擇性”胰島素抵抗。MAPK活性的增強(qiáng)可以促進(jìn)很多生長因子發(fā)揮作用。最為經(jīng)典的是刺激轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的表達(dá)[13]。TGF-β信號(hào)分子是典型的致纖維化因子[14]。但是國

8、內(nèi)學(xué)者對(duì)于TGF-β的大量研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于其的干預(yù)，甚至基因敲除，只能減輕不能完全遏制心肌纖維化的進(jìn)程[15,16]。這提示著在致心肌纖維化中還存在其他信號(hào)通路。Oga等證實(shí)，在肺間質(zhì)纖維化形成過程中，PGF2α-FP通路是除了TGF-β外另一重要的致纖維化的途徑，它獨(dú)立于TGF-β經(jīng)典通路而直接作用于肺成纖維細(xì)胞促進(jìn)其增殖和膠原的合成，導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化[17，18]。而PGF2α-FP通路對(duì)于心肌成纖維細(xì)胞的研究尚未有人涉足。在DCM胰

9、島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α/FP受體信號(hào)通路是否參與了心肌成纖維細(xì)胞膠原的合成研究甚少。
　　PGF2α是花生四烯酸在環(huán)氧化酶作用下的代謝產(chǎn)物。近幾年來發(fā)現(xiàn)，在胰島素抵抗病人的尿液中，或肥胖病人的體內(nèi)，PGF2α的水平是明顯增加的。所以在對(duì)于糖尿病胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下一些病理因子和炎癥因子的研究中，PGF2α的地位受到越來越多人的關(guān)注，日趨重要起來。最近，在對(duì)PGF2α的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PGF2α存在時(shí)，可以與其特異受體FP受體結(jié)合，兩

10、者結(jié)合后可以引起一系列生理活性反應(yīng)。不僅激活PKC、Rho激酶信號(hào)通路，同時(shí)還抑制PI3K的活性。PGF2α與PI3K競爭性結(jié)合FP受體。PI3K位于細(xì)胞內(nèi)，所以當(dāng)PI3K活性受到抑制時(shí)，與其結(jié)合的包內(nèi)FP受體量就會(huì)減少，使FP受體內(nèi)化(internalization)減少，細(xì)胞膜表面上的FP受體量明顯增多，從而可以結(jié)合更多的PGF2α[19-23]，形成正反饋循環(huán)。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，上述正反饋是否依然存在？PGF2α-FP受體/PK

11、C/Rho激酶信號(hào)通路能否誘導(dǎo)大鼠成纖維細(xì)胞分泌膠原的增加，目前尚未有人研究。簽于此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定這樣的假說前提:在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α-FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞膠原的合成。
　　為了驗(yàn)證這一假說，我們進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn):1.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α刺激對(duì)大鼠成纖維細(xì)胞的膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、PGF2α-FP受體相應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響;2.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF

12、2α對(duì)PI3K/Akt、FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路的檢測;3.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，應(yīng)用分子阻斷劑技術(shù)，檢測PGF2α/FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路對(duì)心肌成纖維細(xì)胞合成膠原功能的影響中的作用;4.PGF2α-FP受體信號(hào)通路獨(dú)立于TGF-β1信號(hào)通路的檢測。本研究的主要目的在于，在正常糖條件和胰島素抵抗條件下，PGF2α對(duì)心肌成纖維細(xì)胞膠原合成功能的影響及可能的信號(hào)介導(dǎo)機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.

13、在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α對(duì)心肌成纖維細(xì)胞FP受體、Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響;
　　2.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α對(duì)PI3K/Akt、FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路的檢測;
　　3.在正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，應(yīng)用分子阻斷劑技術(shù)，檢測PGF2α/FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路對(duì)心肌成纖維細(xì)胞合成膠原功能的影響中的作用;
　　4.PGF2α-FP受體信號(hào)通路獨(dú)立于TGF

14、-β1信號(hào)通路的檢測
　　研究方法
　　本研究以原代培養(yǎng)的新生乳鼠心肌成纖維細(xì)胞為對(duì)象。采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(realtimeRT-PCR)，蛋白免疫印跡(westernblotting)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等實(shí)驗(yàn)方法，分別觀察:
　　1.在體外模擬胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，分為正常糖組(5.5mmol/L)、正常糖+PGF2α(5.5mmol/L+PGF2α)、胰島素抵抗模型組+PGF2α（15mmol/L+

15、104μU/ml+PGF2α），檢測FP受體mRNA以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白含量;
　　2.在正常糖組、胰島素抵抗模型組，加入PGF2α刺激0min，30min、60min、120min，觀察PI3K/Akt、FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路的變化;
　　3.在正常糖組、胰島素抵抗模型組，加入FP受體，PKC，Rho激酶抑制劑后，觀察對(duì)PGF2α刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)的影響;
　　4.在正常糖

16、組、胰島素抵抗模型組，加入FP受體，TGF-β1抑制劑后，觀察對(duì)PGF2α或者TGF-β1刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在正常糖和胰島素抵抗模型狀態(tài)下加入PGF2α刺激1h:PGF2α刺激下，與正常糖對(duì)照組相比，模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細(xì)胞FP受體mRNA的表達(dá)均顯著增高(15.06±0.02vs.1.00±0.00;1.86±0.50vs.1.00±0.00，P

17、＜0.05)，且模型+PGF2α組高于正常糖+PGF2α組;模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細(xì)胞FP受體蛋白的表達(dá)也顯著增高（1.13±0.16vs.0.29±0.03;0.69±0.08vs.0.29±0.03，P＜0.05）;刺激4h:與正常糖對(duì)照組相比，模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細(xì)胞FP受體mRNA的表達(dá)均顯著增高（9.36±0.74vs.1.00±0.00;1.28±0.05vs.1.0

18、0±0.00，P＜0.05），且模型+PGF2α組高于正常糖+PGF2α組;模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細(xì)胞FP受體蛋白的表達(dá)也顯著增高(0.56±0.03vs.0.39±0.01;0.47±0.02vs.0.39±0.01，P＜0.05)。模型+PGF2α組和正常糖+PGF2α組心肌成纖維細(xì)胞膠原Ⅰ/Ⅲ的表達(dá)也顯著增高(膠原Ⅰ:18.97±0.87vs.1.00±0.00，3.48±0.70vs.1.00±0.0

19、0;膠原Ⅲ:3.72±0.21vs.1.00±0.00，1.62±0.14vs.1.00±0.00);刺激24h:（膠原Ⅰ:29.46±3.00vs.6.81±0.47,17.95±0.79vs.6.81±0.47;膠原Ⅲ:5.10±0.10vs.1.23±0.027,3.20±0.033vs.1.23±0.027）。
　　2.在正常糖條件下和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α不僅使心肌成纖維細(xì)胞PI3K、AKT磷酸化水平均顯著下降;還

20、使FP受體、PKC、Rho激酶活化程度均顯著增加。
　　3.正常糖條件下，與PGF2α組相比，F(xiàn)P受體抑制劑AL-8810、PKC抑制劑LY-333531、Rho激酶抑制劑Y-27632可明顯抑制PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA和蛋白水平的增加(P＜0.05)，膠原ⅠmRNA下降了47.59％、49.11％、49.00％，膠原ⅢmRNA下降了21.5％、27.25％、21.76％;膠原Ⅰ蛋白下降了14.83％、19.31％、14

21、.11％，膠原Ⅲ蛋白下降了9.5％、13.45％、17.89％。胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，與PGF2α組相比，AL-8810、LY-333531、Y-27632可明顯抑制PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA和蛋白水平的增加(P＜0.01～0.001)，膠原ⅠmRNA下降了80.48％、82.03％、83.50％，膠原ⅢmRNA下降了26.49％、29.60％、36.08％，膠原Ⅰ蛋白下降了41.62％、35.07％、41.71％，膠原Ⅲ蛋白下降了

22、22.33％、18.13％、18.20％。
　　4.在正常糖條件下和胰島素抵抗模型條件下，AL-8810、AL-8810+SB-505124可明顯抑制PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加（P＜0.05），但是SB-505124對(duì)PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加無明顯抑制作用(P＞0.05);增加SB-505124的濃度至10μmol/，仍然對(duì)PGF2α引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加無明顯抑制作用;同樣SB-

23、505124、AL-8810+SB-505124可明顯抑制TGF-β1引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加(P＜0.05)，但是AL-8810對(duì)TGF-β1引起的膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平的增加無明顯抑制作用（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下PGF2α可顯著增高心肌成纖維細(xì)胞FP受體和膠原Ⅰ、Ⅲ的表達(dá)水平
　　2.在正常糖條件下和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α不僅使FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路

24、激活還鈍化PI3K/Akt信號(hào)通路。
　　3.在正常糖條件和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α可通過FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路刺激大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原Ⅰ、ⅢmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　4.正常糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α刺激膠原表達(dá)Ⅰ、Ⅲ的增加均是通過FP受體信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，其作用獨(dú)立于TGF-β1信號(hào)通路。
　　論文Ⅱ:FP受體基因沉默對(duì)糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用
　　背景：
　　糖

25、尿病心肌病是由糖尿病引起的心肌的結(jié)構(gòu)和功能的改變的代謝紊亂性疾病。現(xiàn)有的流行病學(xué)和臨床資料標(biāo)明，糖尿病心肌病亦是升高糖尿病患者罹難率和罹患率的首要病因，因此作為一種獨(dú)立的，特異的心肌病變，受到越來越多人的關(guān)注[1,2]。最近十幾年來，心血管領(lǐng)域眾多學(xué)者對(duì)它的發(fā)病的復(fù)雜機(jī)制進(jìn)行大量的臨床實(shí)驗(yàn)研究和基礎(chǔ)研究，對(duì)于其最終的發(fā)病機(jī)制的探討仍然不成熟。故而，對(duì)于更進(jìn)一步探討糖尿病心肌病的最終發(fā)病的機(jī)制，研究遏制糖尿病心肌病的發(fā)病的途徑對(duì)其防治有歷

26、史性意義。
　　糖尿病心肌病的發(fā)生與眾多因素復(fù)雜相關(guān)，是一個(gè)極其復(fù)雜的病理過程。其中，代謝紊亂（高糖血癥和高胰島素血癥），心肌細(xì)胞的自噬和凋亡，心肌間質(zhì)纖維化，微血管的病變等都是糖尿病心肌病的病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病心肌組織形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積和心肌纖維化[3]。所以，心肌纖維化在糖尿病心肌病中的作用日益受到重視，但是其具體機(jī)制仍未完全闡明。
　　心肌間質(zhì)纖維化的機(jī)

27、制錯(cuò)綜復(fù)雜，胰島素抵抗，炎癥，激素的作用都會(huì)引起心肌間質(zhì)纖維化。目前為止，許多學(xué)者逐一研究了上述各個(gè)原因與纖維化的關(guān)系[4,5]。但是，胰島素抵抗與激素相互作用與心肌纖維化的研究，尚未有人涉足。因此，深入研究胰島素抵抗與各種相關(guān)激素之間的相互作用與心肌纖維化之間的深層鏈接的關(guān)系具有深遠(yuǎn)的意義。
　　胰島素抵抗在纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[5]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PI3K/Akt這一代謝信號(hào)通路受損[6,7]。PI3K/Ak

28、t信號(hào)通路的弱化會(huì)導(dǎo)致PGF2α與FP受體的過度結(jié)合，因?yàn)镻GF2α與PI3K競爭性結(jié)合FP受體[8]。近幾年來，PGF2α作為一個(gè)新的致纖維化的激素受到越來越多的關(guān)注。Oga已經(jīng)證實(shí)，PGF2α與FP受體結(jié)合可以促進(jìn)肺間質(zhì)膠原沉積，從而導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化[9,10]。另一方面，PGF2α與FP受體結(jié)合后可以活化PKC[11]或者Rho激酶[10];而PKC和Rho激酶是經(jīng)典的致纖維化因子，兩者之間不僅能相互作用[12]，而且能引起纖維化

29、[13,14]。但是，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α-FP受體/PKC/Rho激酶信號(hào)通路能否引起心肌間質(zhì)纖維化，目前未見相關(guān)研究。
　　因此，我們提出這樣的假設(shè)，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，PGF2α/FP受體PKC/Rho激酶信號(hào)通路可能參與了糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化的過程。所以，我們建立了二型糖尿病動(dòng)物模型，運(yùn)用FP受體基因沉默技術(shù)來研究PGF2α-FP受體對(duì)糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化影響及可能的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　目的：<

30、br>　　1.建立二型糖尿病動(dòng)物模型和糖尿病基因沉默動(dòng)物模型
　　2.探討在糖尿病狀態(tài)下和基因沉默狀態(tài)下，PGF2α-FP受體對(duì)糖尿病心肌病心肌間質(zhì)纖維化影響及可能的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制
　　方法：
　　雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組（n=8只），糖尿病組(n=32只)，正常對(duì)照組大鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);糖尿病組大鼠以高脂高糖高熱量飼料喂養(yǎng)。四周后，糖尿病組大鼠禁食12h后，腹腔內(nèi)注射鏈脲菌素(STZ)27.5mg/

31、kg，正常對(duì)照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。注射STZ一周后，連續(xù)三次通過尾靜脈取血檢測動(dòng)物血糖，若空腹血糖＞7.1或者隨機(jī)血糖＞11.1者納入糖尿病模型組。此時(shí)，糖尿病組大鼠分為四個(gè)亞組:糖尿病組(n=7)，糖尿病+空載體注射組(n=7)，糖尿病+腺病毒（FP受體sh-RNA）注射組(n=7)，糖尿病+腺病毒（FP受體sh-RNA）注射+PGF2α注射組(n=7)。動(dòng)物血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)14周。在第19周末，采用頸靜脈注射法

32、給予腺病毒組大鼠注射腺病毒2.5*1010PFU，給予空載體組大鼠注射同等量的空載體。兩周后，即第21周末，重復(fù)注射同等劑量的腺病毒;同時(shí)，最后一組，即糖尿病+腺病毒（FP受體sh-RNA）注射+PGF2α注射組，給予PGF2α(0.1mg/kg)連續(xù)肌肉注射2周。第23周，處死動(dòng)物，留取動(dòng)物標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)過程中，進(jìn)行以下檢測:①實(shí)驗(yàn)?zāi)┐笫篌w重測量和心臟重量測量，血壓，飲水，飲食，以及尿量檢測。②分別于實(shí)驗(yàn)開始基線水平，注射STZ前（四周高

33、脂飲食喂養(yǎng)后）、注射STZ后1周、糖尿病中期（第17周）、注射腺病毒前和實(shí)驗(yàn)?zāi)╊i靜脈取血測定空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、膽固醇，PGF2α，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(1SI)。③分別于實(shí)驗(yàn)開始基線水平、四周高脂喂養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行胰島素耐量和糖耐量檢測。④于實(shí)驗(yàn)?zāi)┮孕膶?dǎo)管法進(jìn)行左室舒張末壓(LVEDP)檢測。⑤應(yīng)用H&E，Masson，天狼猩紅染色進(jìn)行心肌組織間質(zhì)膠原定量。⑥實(shí)時(shí)定量RT-PCR法和WB法檢測FP受體mRNA和蛋白的表達(dá)以

34、及PKC和Rho激酶的表達(dá)。⑦采用免疫組織化學(xué)法檢測膠原Ⅰ/Ⅲ蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況
　　與正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠心臟重量，飲水，飲食以及尿量明顯增加。給予FP受體基因沉默治療后，與空載體組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組飲水和尿量明顯減少，心臟重量和飲食量稍微減少。
　　2.大鼠生化指標(biāo)檢測
　　高脂高熱量飼料喂養(yǎng)4周后，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組血清甘油三

35、酯和空腹血糖明顯上升(P＜0.05)，血清膽固醇，PGF2α和空腹胰島素升高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯下降（P＜0.05）。
　　STZ注射后1周，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組血清膽固醇，甘油三酯，空腹血糖，PGF2α和空腹胰島素明顯升高（P＜0.01）;胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯下降(P＜0.01)，這種狀態(tài)一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)?zāi)?br>　　實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與糖尿病組相比:單純腺病毒注射組和腺病毒+PG

36、F2α注射組，血清膽固醇，甘油三酯，空腹血糖和空腹胰島素明顯下降（P＜0.05），胰島素敏感指數(shù)(ISI)也明顯上升(P＜0.05)，PGF2α水平仍然很高(P＜0.05)。
　　3.大鼠糖耐量和胰島素耐量檢測
　　與基線水平相比，高脂高熱量飼料喂養(yǎng)4周后，糖尿病組大鼠胰島素耐量和糖耐量開始受損，糖耐量和胰島素耐量曲線下面積AUC明顯增加，這種狀態(tài)一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)?zāi)?br>　　實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與糖尿病組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒

37、+PGF2α注射組胰島素耐量和糖耐量明顯改善，糖耐量和胰島素耐量曲線下面積AUC明顯降低。
　　4.大鼠心導(dǎo)管檢測
　　與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠舒張末期左室內(nèi)壓力(LVEDP)明顯增加;給予腺病毒注射后，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組LVEDP明顯下降。
　　5.組織形態(tài)學(xué)觀察
　　正常對(duì)照組心肌左室和血管周圍膠原組織分布均勻，糖尿病組心肌內(nèi)和管周膠原含量明顯增多。定量分析結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比

38、，糖尿病組左室心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)和血管周圍纖維化指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。給予腺病毒治療后，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組，心肌膠原含量顯著下降，血管周圍纖維化程度減弱。定量分析結(jié)果顯示:與空載體組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組，心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)和血管周圍纖維化指數(shù)明顯下降(P＜0.05)。天狼猩紅染色也觀察到同樣的結(jié)果。
　　6.信號(hào)通路檢測
　　與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠體內(nèi)FP受體

39、mRNA和蛋白質(zhì)的含量明顯增加，磷酸化PKCβ2和MYPT-1水平也明顯增加，磷酸化Akt活性明顯下降;給予FP受體基因沉默治療后，不僅FP受體mRNA和蛋白質(zhì)的含量明顯下降，磷酸化PKCβ2和MYPT-1水平也明顯下降;受損的Akt活性逐漸恢復(fù)。
　　7.免疫組化檢測心肌組織FP受體分布
　　從免疫組織化學(xué)圖片上顯示，我們可以看出，與對(duì)照組相比，糖尿病狀態(tài)下，F(xiàn)P受體的分布廣泛而密集，表達(dá)量增加;給予FP受體腺病毒注射后，

40、FP受體分布相對(duì)稀疏而零散，表達(dá)量減少，同樣FP受體腺病毒注射后，即使同時(shí)又給予PGF2。注射，F(xiàn)P受體分布與單純FP受體腺病毒干預(yù)組相比沒有明顯變化;統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果亦得到同樣結(jié)果。
　　8.免疫組化檢測膠原Ⅰ/Ⅲ
　　免疫組化顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組膠原Ⅰ/Ⅲ的蛋白表達(dá)明顯上調(diào);FP受體基因沉默治療后，與空載體組相比，單純腺病毒注射組和腺病毒+PGF2α注射組膠原Ⅰ/Ⅲ表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1.四

41、周高脂高熱量飲食，糖尿病組大鼠體內(nèi)出現(xiàn)代謝紊亂，這種代謝紊亂一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)?zāi)?四周腺病毒注射后，代謝紊亂得到了緩解。
　　2.糖尿病組大鼠出現(xiàn)糖耐量受損和胰島素抵抗;FP受體基因沉默治療后，這種糖耐量受損和胰島素抵抗得到了一定程度的改善。
　　3.在糖尿病大鼠體內(nèi)出現(xiàn)心臟舒張功能障礙，給予FP受體腺病毒基因沉默治療后，心臟舒張功能障礙得到一定程度的改善。
　　4.在2型糖尿病動(dòng)物體內(nèi)存在心肌間質(zhì)纖維化現(xiàn)象，給予FP受體