紫杉醇長循環(huán)免疫脂質(zhì)體的制備和評價.pdf

1、由于紫杉醇極低的溶解度,臨床上將其增溶在聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇(50:50,v/v)的混合物中用于治療卵巢癌,乳腺癌,非小細(xì)胞肺癌等。然而,該載體會引起許多毒副作用,包括過敏反應(yīng),神經(jīng)毒性,影響了它的臨床應(yīng)用。本論文試圖采用脂質(zhì)體技術(shù)將紫杉醇包封在脂質(zhì)體中以提高紫杉醇的含量,并改善紫杉醇脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。首先,在紫杉醇普通脂質(zhì)體的研究過程中,考察了水化介質(zhì)、膽固醇含量、磷脂含量、藥物含量及不同類型的磷脂對紫杉醇脂質(zhì)體的包封率的影響。結(jié)果

2、顯示,水化介質(zhì)中加入3％(v/v)Tween-80能夠提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和磷脂薄膜的水化速度。控制磷脂S100PC的濃度為10％(w/v),磷脂與膽固醇的摩爾比為90:10,紫杉醇在處方中為3.5 mg/mL,可將紫杉醇在水中的溶解度從大約1μg/mL提高到3.39mg/mL。在水化介質(zhì)中加入5％(v/v)PEG400,能夠進一步提高脂質(zhì)體的包封率到89.26％,并能提高紫杉醇在脂質(zhì)體凍干粉末中的含量。為了進一步改善紫杉醇脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

3、,將脂質(zhì)體溶液進行冷凍干燥。蔗糖(蔗糖與磷脂的摩爾比例為2.3:1)作為凍干保護劑,能夠保持脂質(zhì)體在冷凍干燥過程中的完整性。細(xì)胞毒性研究顯示,紫杉醇脂質(zhì)體對人的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的細(xì)胞毒性與Taxol(R)相似。
　　 在研究普通紫杉醇脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上,為了提高脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時間,制備了長循環(huán)脂質(zhì)體。水化介質(zhì)中加入3％(v/v)Tween-80能夠提高紫杉醇在長循環(huán)脂質(zhì)體溶液中的含量到3.28 mg/mL,能夠滿足

4、紫杉醇的臨床需求(0.3～1.2 mg/mL)。在冷凍干燥過程中蔗糖的加入提高了長循環(huán)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,為脂質(zhì)體的長期儲存提供了條件。體外釋放研究顯示紫杉醇從長循環(huán)脂質(zhì)體中的釋放是一個緩慢的過程,24 h僅僅釋放了33％,明顯低于普通脂質(zhì)體(24 h釋放了55％)和Taxol(R)溶液(24 h內(nèi)完全釋放)。體外細(xì)胞毒性試驗顯示,經(jīng)過24 h培養(yǎng),長循環(huán)脂質(zhì)體對MDA-MB-231和SK-BR-3兩種人的乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性比Taxol(

5、R)弱,但是經(jīng)過72 h的培養(yǎng),兩者顯示出相似的細(xì)胞毒性。
　　 本論文采用后插入法成功的制備了靶向人上皮細(xì)胞增長因子2(HER2)高度表達(dá)的乳腺癌的長循環(huán)免疫脂質(zhì)體。硫化的抗體能夠成功的連接到連接磷脂的遠(yuǎn)端,并插入到長循環(huán)脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中。Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis(SDS-PAGE)分析顯示抗體赫賽汀(Herceptin)在整個免疫脂

6、質(zhì)體的制備過程中能夠保持結(jié)構(gòu)完整性。同時考察了Herceptin的生物活性,游離的抗體,硫化抗體和連接在免疫脂質(zhì)體上的抗體對HER2高度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞(SK-BR-3和BT-474)顯示出相似的細(xì)胞毒性,確認(rèn)了生物活性的良好保持。體外釋放研究顯示,紫杉醇從長循環(huán)免疫脂質(zhì)體中的釋放與其從長循環(huán)脂質(zhì)體中的釋放無明顯的差異(p>0.05),是一個緩慢的過程,24 h僅僅釋放了36％。共聚焦激光掃描顯微鏡研究確認(rèn)了Herceptin能夠使長循

7、環(huán)免疫脂質(zhì)體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進入到HER2高度表達(dá)的細(xì)胞的內(nèi)部,然而對于長循環(huán)脂質(zhì)體卻不能發(fā)現(xiàn)任何的熒光標(biāo)記。對于BT-474和SK-BR-3細(xì)胞,Herceptin與游離的紫杉醇或者脂質(zhì)體包封的紫杉醇的細(xì)胞毒性具有加合作用；長循環(huán)免疫脂質(zhì)體顯示出比Herceptin和長循環(huán)脂質(zhì)體聯(lián)合應(yīng)用更加強的細(xì)胞毒性。通過細(xì)胞攝取研究發(fā)現(xiàn),在37℃和HER2高度表達(dá)的細(xì)胞條件下,通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞,長循環(huán)免疫脂質(zhì)體顯示出比長循環(huán)脂質(zhì)體明顯高的細(xì)胞

8、攝取率；然而在4℃和HER2低表達(dá)的細(xì)胞則無顯著的差異；該結(jié)果與共聚焦激光掃描顯微鏡研究的結(jié)果一致。
　　 四種制劑在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)結(jié)果表明,長循環(huán)脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時間最長,其次為長循環(huán)免疫脂質(zhì)體,再次為普通脂質(zhì)體,最后為市售紫杉醇劑型Taxol(R)。以市售紫杉醇劑型Taxol(R)為參比制劑,紫杉醇普通脂質(zhì)體的相對生物利用度為160％；長循環(huán)脂質(zhì)體和長循環(huán)免疫脂質(zhì)體的相對生物利用度分別為712.75％和390.83％

9、。接著在MDA-MB-231和BT-474兩種動物模型上考察了游離的紫杉醇及紫杉醇脂質(zhì)體的體內(nèi)組織分布,對于MDA-MB-231動物模型,長循環(huán)脂質(zhì)體因為擁有最長的體內(nèi)循環(huán)時間,從而在腫瘤部位具有最高的藥物累積量,其次為長循環(huán)免疫脂質(zhì)體,再次為普通脂質(zhì)體,最后為Taxol(R)。對于BT-474動物模型,長循環(huán)免疫脂質(zhì)體在腫瘤部位的累積量與長循環(huán)脂質(zhì)體無明顯差異,再次為普通脂質(zhì)體,最后為Taxol(R)。
　　 通過建立MDA-

10、MB-231和BT-474兩種人的乳腺癌異種移植裸鼠模型,以生理鹽水為對照,研究了Taxol(R),紫杉醇普通脂質(zhì)體,長循環(huán)脂質(zhì)體和長循環(huán)免疫脂質(zhì)體的藥效學(xué)。對于MDA-MB-231裸鼠模型,長循環(huán)脂質(zhì)體和長循環(huán)免疫脂質(zhì)體抗腫瘤效果好,兩者間療效無明顯的差異；其次為普通脂質(zhì)體,再次是Taxol(R)。對于BT-474裸鼠模型,長循環(huán)免疫脂質(zhì)體的療效最好,其次為長循環(huán)脂質(zhì)體,再次為普通脂質(zhì)體,最后為Taxol(R)。藥效學(xué)試驗結(jié)果顯示了所

11、制備的紫杉醇脂質(zhì)體能夠顯著的改善紫杉醇的抗腫瘤效果,是一種有前途的紫杉醇載體系統(tǒng)。
　　 綜上所述,本文采用脂質(zhì)體技術(shù)將紫杉醇包封在脂質(zhì)體中,通過Tween-80的應(yīng)用,極大地提高了紫杉醇在脂質(zhì)體溶液中的含量(>3 mg/mL),通過冷凍干燥技術(shù)將脂質(zhì)體凍干,提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。通過插入聚乙二醇化的磷脂,將脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的平均滯留時間從普通脂質(zhì)體的3.15 h提高到18.75 h,延長了脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時間。將Hercep