三種抗酸染色痰涂片前處理方法的效果評(píng)價(jià).pdf

1、目的:
　　 本研究通過(guò)采用紫外線照射法、次氯酸鈉溶液消毒法及高壓蒸汽滅菌法三種方法對(duì)抗酸染色痰涂片進(jìn)行前處理，評(píng)價(jià)其對(duì)抗酸染色鏡檢的影響及其消毒效果。為資源有限、處于結(jié)核病職業(yè)暴露高危環(huán)境中的基層實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行抗酸染色痰涂片鏡檢，提供簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的方法，滅活涂片中分枝桿菌，以提高基層實(shí)驗(yàn)室生物安全。
　　 方法:
　　 1.收集萋尼氏抗酸染色陽(yáng)性的痰液，并測(cè)定紫外線照射距離、輻照強(qiáng)度，以及次氯酸鈉溶液有

2、效氯濃度。
　　 2.痰涂片抗酸染色鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng):將痰液充分混勻后分為四份，分別用于對(duì)照組、紫外線照射組、次氯酸鈉溶液消毒組及高壓蒸汽滅菌組。對(duì)照組首先采用直接涂片方式制備2張涂片，一張進(jìn)行抗酸染色，作為涂片鏡檢對(duì)照;一張經(jīng)火焰固定后刮取痰膜進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng);剩余痰液接種改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)，作為培養(yǎng)對(duì)照。紫外線照射組將涂片置于生物安全柜內(nèi)紫外燈下，分別照射10min、20min、40min、60min、80

3、min后進(jìn)行抗酸染色鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)。次氯酸鈉溶液消毒組的痰液因向痰液中加入等量次氯酸鈉溶液消化處理10～15min后，集菌方法不同，分為兩小組，一組離心法是加入等量的蒸餾水，混勻，然后以2500rpm速度離心15min;一組沉淀法則是加蒸餾水至15mL，混勻，室溫中靜置過(guò)夜(15h～18h)。兩組集菌后取沉淀進(jìn)行涂片染色鏡檢以及接種培養(yǎng)。高壓蒸汽滅菌組將痰液放入高壓蒸汽滅菌鍋中(壓力103.4kPa，溫度121℃)，滅菌20min后

4、以2500rpm速度離心15min，取沉淀進(jìn)行涂片抗酸染色鏡檢。因高壓蒸汽滅菌可殺滅所有微生物，故高壓滅菌后的痰液不再進(jìn)行培養(yǎng)工作。
　　 3.菌種鑒定:培養(yǎng)對(duì)照分離培養(yǎng)陽(yáng)性菌株，進(jìn)行菌種鑒定。采用雙重PCR進(jìn)行分枝桿菌菌群鑒定，劃歸是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)或非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。鑒定結(jié)果若是MTBC，則采用7對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群各菌種特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行MTBC菌種鑒定;鑒定結(jié)果若是NTM，則采用DNA微

5、陣列芯片法進(jìn)行NTM菌種鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1.本次研究共收集抗酸染色陽(yáng)性痰液73份，直接涂片染色鏡檢結(jié)果為抗酸桿菌陽(yáng)性1～8條/300視野8份，抗酸桿菌陽(yáng)性(1+)6份，抗酸桿菌陽(yáng)性(2+)18份，抗酸桿菌陽(yáng)性(3+)11份，抗酸桿菌陽(yáng)性(4+)30份。痰分枝桿菌分離培養(yǎng)對(duì)照結(jié)果與火焰固定后培養(yǎng)結(jié)果相同，共分離分枝桿菌陽(yáng)性菌株65株，經(jīng)鑒定MTBC60株，其中結(jié)核分枝桿菌58株，田鼠分枝桿菌2株;NTM5株，其

6、中龜膿腫分枝桿菌4株，胞內(nèi)分枝桿菌1株。
　　 2.紫外線照射組，其痰涂片上抗酸桿菌的染色性、形態(tài)以及其Z-N抗酸染色鏡檢分級(jí)結(jié)果均與對(duì)照組涂片相同，即紫外線照射痰涂片不影響其抗酸染色鏡檢。輻照度為332～360μw/cm2的紫外線，照射60min，即紫外線輻照劑量達(dá)到1195200μw·s/cm2～1296000μw·s/cm2時(shí)，痰涂片分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性，即達(dá)到殺滅分枝桿菌的目的。用相同輻照強(qiáng)度的紫外線照射痰涂片，其殺滅分

7、枝桿菌的效果與照射時(shí)間、涂片含菌量有顯著關(guān)系（P＜0.05）。對(duì)同一痰液樣本，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)生長(zhǎng)的菌落數(shù)逐漸少。紫外線輻照強(qiáng)度、照射時(shí)間相同的情況下，菌量與培養(yǎng)陽(yáng)性比例存在線性趨勢(shì)（P＜0.05)，菌量越多，培養(yǎng)陽(yáng)性比例越大，即殺菌效果越差。要達(dá)到殺滅分枝桿菌的目的，菌量越多，需照射時(shí)間越長(zhǎng)。
　　 3.本次研究顯示有效氯濃度為50g/L的次氯酸鈉溶液處理痰液10～15min，其涂片抗酸染色鏡檢鏡下視野背景單一、

8、干凈、清晰，次氯酸鈉溶液離心法與沉淀法鏡檢結(jié)果沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，但與對(duì)照組相比，其鏡檢結(jié)果分級(jí)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05)，并出現(xiàn)高假陰性。該組中所有分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性。
　　 4.高壓蒸汽滅菌組，其鏡下背景干凈、清晰，經(jīng)離心后其抗酸染色鏡檢結(jié)果分級(jí)與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05)，高于對(duì)照組。痰液經(jīng)高壓滅菌后，涂片痰膜較脆弱，在染色過(guò)程中，易脫落，影響隨后的顯微鏡檢查。
　　 結(jié)論:
　　 1

9、.火焰固定不能殺死涂片中的分枝桿菌，在日常工作中，涂片進(jìn)行抗酸染色之前，進(jìn)行前處理，滅活分枝桿菌，對(duì)降低實(shí)驗(yàn)室獲得性感染，提高實(shí)驗(yàn)室生物安全有重要意義。本研究證實(shí)紫外線照射法、次氯酸鈉溶液消毒法可滅活痰涂片中的結(jié)核分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、龜膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌。
　　 2.紫外線照射對(duì)痰涂片抗酸染色鏡檢沒(méi)有影響。利用紫外線消毒痰涂片，涂片制備要厚度適宜、涂抹均勻，紫外線輻照劑量至少達(dá)到1195200μw· s/cm2，使用