順鉑對Lewis肺癌小鼠體內(nèi)MDSC的影響及其可能機制的探討.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:化療藥物在損傷腫瘤細胞的同時也干擾機體的免疫系統(tǒng)。化療后荷瘤機體內(nèi)的免疫格局形成對腫瘤的復(fù)發(fā)、進展等有重要意義。髓系來源抑制性細胞(Myeliod Derived-suppressor Cells,MDSCs)是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫抑制的重要細胞,并成為腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受的研究熱點之一。MDSC作為一群未成熟的免疫抑制性細胞在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤機體中異常聚集,這與體內(nèi)的諸多調(diào)節(jié)性因子發(fā)生變化有關(guān)。活細胞損傷釋放出具有免疫調(diào)節(jié)活性的

2、損傷相關(guān)分子模式(Damage Associated Molecular patterns,DAMPs),半乳糖凝集素3(Galectin-3)是凝集素家族中的一員,也是DAMPs中的主要成員之一。許多化療藥物在體外可直接影響MDSC的聚集和分化,順鉑作為肺癌治療的常用藥物之一,對MDSC的作用尚不明確,其能否通過DAMPs的成員--Galectin-3來影響MDSC也有待闡明。因此,本實驗通過建立Lewis肺癌小鼠模型,觀察順鉑對荷瘤

3、小鼠體內(nèi)MDSC及Galectin-3的影響,同時探討Galectin-3對MDSC的分化、遷移及細胞活性的作用。
  方法:(1)建立Lewis肺癌(LCC)小鼠模型,不同濃度(0.4mg/kg、4mg/kg)順鉑處理后,取小鼠腫瘤組織、脾臟和外周血,采用組織免疫熒光及流式細胞術(shù)(flowcytometry,F(xiàn)CM)檢測腫瘤組織和脾臟中MDSC的數(shù)量,免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測腫瘤組織

4、中的Galectin-3的濃度,酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測小鼠血漿中的Galectin-3的濃度。(2)培養(yǎng)Lewis肺癌細胞,應(yīng)用免疫熒光
  (Immunofluorescence,IF)、FCM檢測其Galectin-3的表達。順鉑處理前后,采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中的Galcetin3的濃度。(3) CDllb磁珠分選荷瘤小鼠脾臟中的MDSC

5、,采用Transwell小室檢測Lewis肺癌細胞上清液及Galectin-3對MDSC的趨化作用,Western Blot、ELISA檢測Galectin-3在MDSC中的表達。(4) CDllb磁珠分選荷瘤小鼠脾臟中的MDSC,采用流式細胞儀通過Annexin V/PI法檢測不同濃度(luM、50uM) Galectin-3、不同時間(12h、24h)對MDSC存活狀況的影響。(5)取小鼠骨髓,制成單細胞懸液,20ng/ml GM-

6、CSF誘導(dǎo)其分化,在第2、4天應(yīng)用流式細胞儀檢測Galectin-3(l00ng/ml)干預(yù)對骨髓原始細胞分化方向的影響。
  結(jié)果:(1)組織免疫熒光結(jié)果顯示:MDSC在Lewis肺癌小鼠模型的腫瘤組織中均有浸潤,順鉑在一定的濃度范圍內(nèi)能顯著升高腫瘤組織中的MDSC數(shù)量,與對照組相比,不同濃度組MDSC的升高均具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細胞儀檢測脾臟中的MDSC的數(shù)量結(jié)果顯示,NS、0.4mg/kg、4mg/kg

7、順鉑作用于荷瘤小鼠,隨著濃度增大,脾臟中的MDSC的數(shù)量逐漸增多,MDSC在脾臟單細胞懸液中所占的百分率分別為4.1%、13.6%、26.7%。(2)免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:對照組未經(jīng)順鉑處理的荷瘤小鼠的腫瘤組織中,Galectin-3的染色強度較低,顏色較淡,陽性細胞數(shù)目較少;用藥組染色強度明顯增強,陽性細胞數(shù)目增多,陽性細胞呈現(xiàn)棕黃色顆粒,顆粒粗大,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ELISA檢測結(jié)果顯示:順鉑處理L

8、ewis肺癌荷瘤小鼠5天之后,小鼠外周血中的Galectin-3的濃度分別是1.58±0.87ng/ml、3.6±1.1ng/ml、4.7±0.56ng/ml,比較處理組和對照組的濃度值,0.4mg/kg處理組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而4mg/kg處理組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),4mg/kg處理組與0.4mg/kg處理組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(3) IF、FCM及ELISA檢測Le

9、wis肺癌細胞中Galectin-3的表達結(jié)果顯示:Galectin-3在LCC細胞壁上和細胞質(zhì)中均表達,在細胞膜的表達率為78.3%,在細胞質(zhì)中的表達率為95.8%,且能分泌至細胞上清液中,順鉑干預(yù)24小時后,細胞上清液中的Galectin-3的濃度升高,對照組為9.23±2.54ng/ml,2uM順鉑處理組為14.26±2.16ng/ml,因此,LLC細胞能分泌Galectin-3到周圍環(huán)境中,順鉑處理能使其表達增多。(4)采用Tr

10、answell小室檢測LLC細胞培養(yǎng)上清液及Galectin-3對MDSC的趨化作用,結(jié)果顯示:LLC細胞上清液對MDSC具有趨化作用,加入抗小鼠Galectin-3抗體后顯著降低其趨化作用,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。采用ELISA及Western Blot檢測MDSC中Galectin-3的表達結(jié)果顯示:MDSC中存在Galectin-3的表達并且Galectin-3在MDSC細胞上清液中存在。(5) FCM檢測Galect

11、in-3在體外對MDSC存活的影響,結(jié)果顯示,Galectin-3在luM、50uM濃度范圍作用12h、24h內(nèi)不能抑制MDSC凋亡,也不能誘導(dǎo)MDSC凋亡。(6)采用FCM檢測Galectin-3在體外對小鼠骨髓細胞分化方向的影響,結(jié)果顯示:Galectin-3能抑制骨髓前體細胞向成熟的樹突狀細胞分化,誘導(dǎo)MDSC生成。l00ng/ml Galectin-3作用于骨髓前體細胞4天后,MDSC的比例為46.7%、DC為14.7%,對照組

12、分別為22.8%、21.3%。
  結(jié)論:(1)一定濃度順鉑干預(yù)后,Lewis肺癌小鼠中的MDSC數(shù)量增高,并在腫瘤微環(huán)境中聚集;腫瘤微環(huán)境及外周血的Galectin-3濃度升高。(2) Lewis肺癌細胞表達Galectin-3,順鉑體外處理后,表達升高。(3)腫瘤來源的Galectin-3在體外能引起MDSC聚集,說明Galectin-3在MDSC聚集過程中發(fā)揮一定的作用,同時,MDSC也表達Galectin-3,可形成正向反

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