順鉑聯(lián)合DC疫苗抗腫瘤作用及其機制探討.pdf

1、目的:傳統(tǒng)的觀點認為臨床進行的常規(guī)放化療均不能有效地激活針對腫瘤細胞的免疫應答；但近年來,越來越多的證據(jù)證明死亡的腫瘤細胞可釋放一些關鍵因子,或激活或抑制腫瘤細胞周圍的免疫細胞。目前已觀察到多種化療藥如蒽環(huán)類抗生素、histone deacetylase inhibitors(HDACi)等在殺死腫瘤細胞時,釋放hsp70、HMGB1等“危險信號”,可激活宿主固有及獲得性免疫細胞；環(huán)磷酰胺(CY)也可以通過抑制免疫調(diào)節(jié)性T細胞(T-Re

2、g)增殖及活性提高腫瘤特異性免疫應答。
　　 化療藥物對免疫功能的影響提示我們,適當劑量化療后,聯(lián)合DC疫苗等免疫治療啟動宿主主動腫瘤免疫來進行持續(xù)殺傷是可行的,而且很可能比單純依賴高劑量化療殺傷全部腫瘤細胞更為有效和安全。研究證明腫瘤免疫逃逸的機制不僅由于缺乏抗原,而且與抗原不能被有效提呈給T細胞而不能產(chǎn)生特異性免疫應答有關。因此腫瘤免疫治療的一個巨大挑戰(zhàn)是如何使抗原被有效提呈而激發(fā)有效的抗腫瘤免疫應答。我們前期的實驗已觀察到

3、多種化療藥如紫杉醇、比柔吡星誘導的凋亡或壞死細胞具有較高的免疫原性,且能被體外培養(yǎng)的DC有效攝取。
　　 順鉑屬于細胞周期非特異性藥物,具有細胞毒性,可抑制癌細胞的DNA復制過程,并損傷其細胞膜上結構,有較強的廣譜抗癌作用。有關順鉑與DC疫苗是否具有協(xié)同抗腫瘤作用還鮮有報道。
　　 本研究首先觀察了臨床常用化療藥物順鉑作用B16腫瘤細胞后,對“危險信號”HMGB1、hsp70表達的影響,同時對TGF-β的表達以及對順鉑處

4、理的B16細胞裂解液負載的樹突狀細胞(DC)的活性也進行了分析。然后,本研究以荷瘤小鼠為模型,對順鉑聯(lián)合DC疫苗的抗腫瘤作用及其機制進行了初步探討。
　　 方法:
　　 1觀察順鉑對B16腫瘤細胞凋亡誘導作用
　　 用終濃度10μg/ml的順鉑處理體外培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤B16細胞24h,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　 2 HMGB1、hsp70及TGF-β蛋白表達水平檢測
　　 體外培養(yǎng)的小鼠

5、黑色素瘤B16細胞至對數(shù)生長期,用終濃度10μg/ml的順鉑處理24h,收集細胞,提取細胞總蛋白,Western blot方法觀察HMGB1、hsp70及TGF—β蛋白表達。
　　 3 DC疫苗的制備及其活性檢測
　　 從小鼠股骨獲得骨髓細胞,采用細胞因子GM—CSF與IL-4誘導樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs)分化。在培養(yǎng)的第5d,重新收集DC細胞計數(shù),調(diào)

6、節(jié)細胞數(shù)至1×106/ml,重新將細胞加入24孔細胞培養(yǎng)板,用順鉑處理的野生型B16細胞裂解液負載DC,LPS誘導成熟。流式細胞儀分析DCs表面標記MHCⅡ,ICAM-1,CD86的表達。
　　 4順鉑聯(lián)合DC疫苗抗腫瘤作用及其機制研究
　　 給荷瘤小鼠經(jīng)腹腔注射順鉑(100μg/只),連續(xù)3天,每天一次,然后于瘤內(nèi)注射DC疫苗(3×106/只),觀察腫瘤生長曲線；對小鼠脾臟中腫瘤抗原特異性淋巴細胞的IFN-γ分泌、CT

7、L活性、T-Reg細胞數(shù)進行了檢測,同時,對腫瘤組織中的CD8+T細胞數(shù)及T-Reg細胞數(shù)也進行了觀察和分析。
　　 結果:
　　 1順鉑不僅可誘導B16腫瘤細胞凋亡(凋亡率為20％±4％),還可誘導B16細胞壞死；順鉑作用B16細胞24h后,可明顯提高其HMGB1表達水平,但對hsp70及TGF-β的表達影響不大。
　　 2順鉑處理的B16細胞裂解液可明顯促MHCⅡ,ICAM-1,CD86的表達(順鉑處理組MH

8、CⅡ,ICAM-1,CD86分別為:47％±11％,39％±7％,35％±5％；未經(jīng)順鉑處理組5.6％±2％,3.2％±1.4％,4.1±0.7％),表明用該方法可誘導DC成熟、活化。
　　 3順鉑聯(lián)合DC疫苗對荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯的抑制作用；還可促進荷瘤小鼠脾臟淋巴細胞CTL活性和IFN-γ產(chǎn)生(P<0.05或P<0.01),但對脾臟調(diào)節(jié)性T(T-Reg)的作用不明顯；另外,順鉑聯(lián)合DC疫苗可增加腫瘤組織浸潤淋巴細胞中CD

9、8+數(shù),而下調(diào)調(diào)節(jié)性T(T-Reg)細胞數(shù),使CD8+/T-Reg的比例提高。
　　 結論:
　　 1順鉑以誘導B16腫瘤細胞凋亡和壞死的混合方式誘導細胞死亡；
　　 2適當濃度順鉑處理B16腫瘤細胞后,增加HMGB1蛋白的表達,對hsp70及TGF-β的表達作用不明顯；
　　 3用順鉑處理的B16細胞裂解液負載DC,可促進DC的成熟與活化；
　　 4順鉑與DC疫苗具有協(xié)同抗腫瘤作用；