脂氧素對急性肝衰竭的保護(hù)作用及其作用機(jī)制探討.pdf

1、目的：觀察脂氧素A4(LXA4)對體外大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，觀察LXA4對急性肝衰竭大鼠的保護(hù)作用，并初步探求及作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.原位灌流法分離大鼠Kupffer細(xì)胞（KCs），采用臺盼藍(lán)拒染法測KCs活性，吞噬實驗檢測KCs功能。采用ED1免疫細(xì)胞熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒別KCs純度。
　　 2.脂多糖（LPS）刺激KCs 12小時、24小時、36小時，分別檢測上清中TNF-α的含量，將LXA

2、4與KCs共孵育半小時，后給予LPS，檢測細(xì)胞上清中TNF-α的含量。
　　 3.將肝細(xì)胞與KCs共培養(yǎng)，給予D-氨基半乳糖(D-GalN)/LPS刺激24小時后檢測上清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量，收集肝細(xì)胞，Annexin V-FITC法檢測細(xì)胞凋亡。在給予D-GalN/LPS刺激前半小時先加入LXA4預(yù)孵育,再加入D-GalN/LPS刺激，檢測細(xì)胞上清ALT及AST水平，檢測肝細(xì)胞凋亡。
　　

3、4.采用D-GalN+LPS腹腔注射建立大鼠急性肝衰竭動物模型。實驗分為六組：正常組、模型組、LXA4小、中、大劑量組、四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯（PDTC）組。肝組織病理切片觀察肝組織損傷情況;自動生化儀檢測肝功能；ELISA法檢測血清TNF-α及IL-6水平，Caspase 3 活性檢測試劑盒檢測肝組織Caspase3酶活性；Realtime-PCR檢測TNF-a mRNA及IL-6 mRNA表達(dá);原位末端標(biāo)記法（TUNEL）法檢

4、測肝細(xì)胞凋亡率；分離大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞，提取核蛋白，凝膠電泳遷移率實驗（EMSA）檢測肝細(xì)胞及kupffer細(xì)胞核蛋白NF-κB活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.KCs活性測定：活細(xì)胞數(shù)量在90-96％之間，平均（92.3±2.12）％。每只大鼠分離的KCs總量平均為（2.41±0.32）×1072.KCs吞噬實驗顯示有功能的細(xì)胞數(shù)（95.2±2.58）％。
　　 3.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞純度在

5、（96.3±1.46）％4.LPS刺激Kupffer細(xì)胞后，上清中TNF-α含量在12小時明顯升高，24小時達(dá)到峰值。用LXA4預(yù)孵育組TNF-α含量明顯減少。
　　 5.肝細(xì)胞與KCs共培養(yǎng)后給予D-GalN/LPS刺激24小時，檢測上清液轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高，肝細(xì)胞凋亡率增加，與LXA4預(yù)孵育組比較，P<0.05。
　　 6.大鼠急性肝衰竭時，肝組織炎癥壞死明顯，肝臟轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，血清IL-6及TNF-a水平顯

6、著升高，肝組織TNF-a mRNA及IL-6 mRNA表達(dá)明顯升高，Caspase3活性明顯增強(qiáng)；肝組織TUNEL檢測細(xì)胞凋亡明顯增加，kupffer細(xì)胞及肝細(xì)胞核蛋白NF-κB活性明顯增強(qiáng)；脂氧素組及PDTC組組織學(xué)改變均明顯好轉(zhuǎn)，肝臟轉(zhuǎn)氨酶、細(xì)胞因子及NF-κB活性明顯下降，且脂氧素與療效存在劑量依存關(guān)系；脂氧素大劑量組組及PDTC組比較，上述大部分指標(biāo)之間P<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功分離了大鼠KC

7、s,在數(shù)量活性純度方面均達(dá)到實驗要求。
　　 2.在體外實驗中，LXA4能夠抑制KCs細(xì)胞分泌TNF-α，能夠減少肝細(xì)胞凋亡和壞死。
　　 3.體內(nèi)實驗證實LXA4對急性肝衰竭大鼠具有保護(hù)作用。能夠提高存活率，明顯改善肝臟組織學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)，減少致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量，抑制肝細(xì)胞凋亡，其護(hù)肝作用具有量效關(guān)系。
　　 4.LXA4對大鼠急性肝衰竭的保護(hù)作用部分是通過阻斷kupffer細(xì)胞NF-κB活化，減少致