血管緊張素系統(tǒng)在脂多糖-右旋半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝衰竭中的作用及機制初探.pdf

1、目的:
　　細(xì)菌內(nèi)毒素（endotoxin）廣泛存在于革蘭氏陰性菌及其他微生物如衣原體、立克次體等的細(xì)胞壁成分中，當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后胞壁崩解時釋放出來。其主要的化學(xué)成分是脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）,包括O-特異性鏈、核心多糖和類脂A三部分組成，可引起發(fā)熱、白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞升高，甚至導(dǎo)致內(nèi)毒素休克等全身反應(yīng)。同時LPS又是一種免疫誘導(dǎo)劑，具有多種復(fù)雜的生物學(xué)活性，可激活單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、

2、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等多種靶細(xì)胞合成和分泌各種細(xì)胞因子及其他炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致多種病理和病理生理損害。因此，關(guān)于LPS的毒性、生物學(xué)活性及其作用機制研究成為廣泛關(guān)注的研究熱點。
　　肝臟是體內(nèi)最大的代謝器官，也是清除內(nèi)毒素和解毒的主要臟器。正常人腸腔內(nèi)由于細(xì)菌的繁殖和死亡不斷產(chǎn)生的內(nèi)毒素可通過腸粘膜屏障微量間歇吸收入血，再經(jīng)門靜脈到達(dá)肝臟，很快被枯否細(xì)胞吞噬清除，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當(dāng)急性肝衰竭時，腸道屏障功能削弱，腸源性

3、內(nèi)毒素吸收增加，加上肝臟枯否細(xì)胞的清除功能下降引起內(nèi)毒素滅活減少，最終大量內(nèi)毒素進(jìn)入體循環(huán)從而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。據(jù)報道，內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率在急性肝衰竭中約為80-100%；而肝臟也是體內(nèi)遭受內(nèi)毒素攻擊的首要靶器官：LPS可直接破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成肝竇淤血和肝細(xì)胞壞死，引起能量代謝障礙；同時間接激活以枯否細(xì)胞為主的多種炎癥細(xì)胞，分泌以TNF-α為主的多種炎性因子，介導(dǎo)瀑布樣級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞的損傷，LPS還可增強乙醇和四氯化

4、碳等肝毒性物質(zhì)的肝毒性，加重肝硬化、酒精性肝病等其他原因造成的肝損傷。內(nèi)毒素血癥與肝功能損傷兩者互為因果，相互影響，繼而形成惡性循環(huán)，極大地威脅著患者的生命與安全。如何阻斷該循環(huán)中的某些鏈條，有效防止內(nèi)毒素對肝臟的進(jìn)一步損害是問題的關(guān)鍵。迄今為止，臨床仍缺乏特殊、有效的手段治療內(nèi)毒素引起的肝損傷。
　　脂多糖/D-氨基半乳糖（lipopolysaccharide/D-galactosamine, LPS/D-Gal）所致小鼠急性肝

5、衰竭是國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)可和沿用的動物模型，該模型較為理想地模擬了與臨床病毒性肝衰竭較為相似的肝臟生物化學(xué)及代謝方面的改變及并發(fā)內(nèi)、外源性內(nèi)毒素血癥的情況。為全面地研究肝損傷和內(nèi)毒素血癥之間相互關(guān)系提供基礎(chǔ)，并可為臨床上尋找新的治療急性肝衰竭方案提供可靠的途徑。本課題建立了LPS/D-Gal所致小鼠急性肝衰竭模型，探討了血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ, AngⅡ）在炎癥反應(yīng)中的變化和作用，研究血管緊張素系統(tǒng)在急性肝衰竭病程中的作用

6、及機制，為臨床上危重的急性肝衰竭尋找新的可能治療靶點。
　　方法:
　　1.復(fù)制 LPS/D-Gal誘導(dǎo)的 BALB/c小鼠急性肝衰竭的模型，在LPS/D-Gal處理前0.5小時腹腔注射空白溶劑或不同濃度的卡托普利（captopril）/絡(luò)沙坦（losartan）/三氮脒（diminazene, DIZE），以觀察與血管緊張素系統(tǒng)有關(guān)的不同藥物在急肝衰竭中的作用。
　　2. LPS/D-Gal處理后1.5小時麻醉處死各

7、組小鼠，采集血清和肝臟樣本，檢測樣本中炎癥因子 TNF-α、IL-6的水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測炎癥相關(guān)信號通路NF-κB p65的活性及JNK、p38 MAPK的磷酸化水平。
　　3. LPS/D-Gal處理后6小時麻醉處死各組小鼠，采集血清和肝臟樣本，觀測肝組織受損的病理改變；檢測樣本中炎癥因子AngⅡ、NO與MPO的含量；反應(yīng)肝功能狀況的相關(guān)酶指標(biāo)ALT與AST；反應(yīng)肝臟氧化應(yīng)激水平的指標(biāo) MDA、SOD；TUNEL測定肝組織凋

8、亡情況及凋亡相關(guān)酶 caspase-3，-8，-9的活性測定，蛋白質(zhì)印跡法檢測 cleaved caspase-3活性。
　　結(jié)果：
　　captopril/DIZE能顯著減輕 LPS/D-Gal誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭，但losartan尚未見此作用：
　　1. captopril/DIZE能顯著降低損傷模型組的ALT與AST的水平減輕肝臟的病理學(xué)改變，提高生存率。
　　2. captopril/DIZE能顯著降低

9、血清與肝組織中炎癥相關(guān)介質(zhì) AngⅡ、TNF-α、IL-6、MPO的水平同時上升NO水平，減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　3. captopril/DIZE能提高肝組織SOD的活性，降低MDA水平從而減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　4.captopril/DIZE可以抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase-3,-8,-9的活性，下調(diào)cleaved caspase-3的表達(dá)從而減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝

10、組織凋亡。
　　5.captopril/DIZE可以抑制炎癥相關(guān)信號通路 NF-κB p65活性及MAPK家族中JNK、p38 MAPK的磷酸化水平。
　　結(jié)論:
　　AngⅡ在 LPS/D-Gal誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭的發(fā)病過程中可能起到關(guān)鍵的促炎作用，降低其水平的藥物可以很好地緩解肝組織的損傷程度；ACEI及ACE2激動劑可作為新的靶點用于治療LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭的研究。而應(yīng)用 AT1R受體阻滯劑絡(luò)沙坦并未見對肝臟