胰島素通過PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控急性肺損傷ENaC介導(dǎo)的肺泡液體清除的機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過建立非高血糖的急性肺損傷(ALI)動(dòng)物模型，觀察胰島素對(duì)肺泡液體清除(AFC)和上皮鈉離子通道(ENaC)表達(dá)的調(diào)控，探討胰島素在ALI中的作用;同時(shí)通過體外培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞A549，進(jìn)一步明確在胰島素作用下調(diào)控ENaC可能的信號(hào)通路及作用機(jī)制，為其今后的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)及新思路。
　　方法：
　　(1)成年健康的SD大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后，行頸靜脈置管。
　?、僖葝u素組(LPS+

2、Insulin):通過頸靜脈給予脂多糖(LPS)(5mg/kg)，在給予LPS前16h，微量泵入胰島素(0.1U/kg/h);
　?、阡茁嗝顾兀≒I3K阻斷劑）組(LPS+Insulin+Wortmannin):通過頸靜脈給予LPS（5mg/kg），在給予LPS前16h，微量泵入胰島素(0.1U/kg/h)，同時(shí)在給予LPS前90 min，LPS后90 min和360 min分別靜脈給予渥曼青霉素（0.06mg/kg）。

3、　　③脂多糖(LPS)組:通過頸靜脈給予LPS(5mg/kg)，在給予LPS前16h，微量泵入等量生理鹽水;
　?、軐?duì)照組（Control）:通過頸靜脈給予等量生理鹽水，并在頸靜脈注射前16h微量泵入等量生理鹽水。各組大鼠分別于頸靜脈注射后0、1h、4h、8h抽取靜脈血通過血糖儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血糖和胰島素含量變化。各組SD大鼠抽取靜脈血后處死，并收集完整肺組織。右肺行AFC和肺泡灌洗液(BALF)檢測(cè)，左肺行

4、總肺水含量(TLW)分析。采用HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變，進(jìn)行肺損傷評(píng)分比較。免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織ENaC表達(dá)變化情況。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)測(cè)定肺組織ENaCmRNA及蛋白表達(dá)情況，Akt磷酸化水平和Nedd4-2蛋白表達(dá)情況。
　　(2)體外培養(yǎng)A549細(xì)胞
　?、賹?duì)照組(Control):加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);
　?、谝葝u素組(Insulin):用含胰島

5、素(200 mU/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng);
　?、跮Y294002（PI3K阻斷劑）組(Insulin+LY294002):加入含LY294002(10μ M)的培養(yǎng)基培養(yǎng)30min，然后再加入相同作用濃度的胰島素;
　?、蹵kt抑制劑組(Insulin+Akt inhibitor):加入含Akt抑制劑(100 nM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)30min，然后再加入相同作用濃度的胰島素，各組均在加入胰島素后作用2h。RT-PCR和Western

6、 blot測(cè)定細(xì)胞ENaCmRNA及蛋白表達(dá)情況，Akt磷酸化水平和Nedd4-2蛋白表達(dá)情況，并進(jìn)一步采用免疫共沉淀法檢測(cè)Nedd4-2蛋白與ENaC各亞基的變化關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　(1)通過0、1h、4h、8h檢測(cè)血糖和胰島素含量發(fā)現(xiàn)各組血糖和胰島素變化無顯著差異。LPS組BALF中白介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，髓過氧化物酶(MPO)活性及蛋白含量與對(duì)照組比較顯著增加。胰島素作用后BALF中

7、IL-6，TNF-α，MPO活性及蛋白含量顯著減少，但胰島素引起的變化效應(yīng)又被渥曼青霉素所阻斷。同時(shí)胰島素治療后顯著改善了LPS誘導(dǎo)的肺損傷病理變化，肺損傷病理評(píng)分顯著低于LPS組，但渥曼青霉素阻斷了胰島素作用的效應(yīng)變化。與對(duì)照組比較，LPS組AFC顯著降低，TLW顯著增加。胰島素作用后AFC顯著增加，TLW顯著降低，而渥曼青霉素阻斷了胰島素的效應(yīng)。與LPS組比較，給予胰島素顯著上調(diào)了α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRNA和

8、蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平，Nedd4-2蛋白表達(dá)下降。渥曼青霉素干預(yù)后，α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRNA和蛋白表達(dá)及Akt磷酸化水平下降，Nedd4-2蛋白表達(dá)增加。
　　(2)胰島素作用細(xì)胞后明顯上調(diào)了α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)Akt磷酸化水平增加，Nedd4-2蛋白表達(dá)下降。分別給予LY294002和Akt抑制劑干預(yù)后，α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的mRN

9、A和蛋白表達(dá)下降，Akt磷酸化水平下降，Nedd4-2蛋白表達(dá)增加。進(jìn)一步通過免疫共沉淀檢測(cè)提示胰島素作用后與α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC結(jié)合的Nedd4-2表達(dá)減少。分別給予LY294002和Akt抑制劑干預(yù)后，與α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC結(jié)合的Nedd4-2表達(dá)增加。
　　結(jié)論；
　　(1)胰島素可以促進(jìn)肺泡水腫液的清除，從而減輕ALI肺泡水腫液的聚集，降低肺水含量。
　　(2)胰島素通過