原發(fā)性遠(yuǎn)端腎小管酸中毒的致病基因SLC4A1的研究.pdf

1、腎小管性酸中毒（Renal Tubular Acidosis，RTA）系腎臟酸化功能障礙引起的以低血鉀、高血氯性代謝性酸中毒為特點(diǎn)的一組臨床綜合征，由遠(yuǎn)端腎小管泌氫泌銨功能障礙或和近端腎小管對(duì)碳酸氫根離子重吸收障礙引起1。
　　腎小管酸中毒臨床上分成四型：遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒（Ⅰ型）；近端腎小管性酸中毒（Ⅱ型）；混合型腎小管性酸中毒（Ⅲ型）；高血鉀型腎小管性酸中毒（Ⅳ型）2。根據(jù)病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性常為先天性，遺傳性腎小

2、管功能缺陷；繼發(fā)性見于如干燥綜合征、肝炎病毒感染等疾病，或者因腎臟毒性藥物食物如由馬兜鈴酸類中草藥等引起3。
　　遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒（Distal renal Tubular Acidosis，dRTA），即I型腎小管酸中毒，也是最常見的一種，是由遠(yuǎn)端腎小管分泌氫離子以及分泌銨離子功能障礙所致的代謝性酸中毒等一組綜合征，臨床特點(diǎn)為低血鉀、高氯性代謝性酸中毒、繼發(fā)性骨病、以及腎臟鈣化、結(jié)石等。
　　原發(fā)性遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒主要

3、與遺傳相關(guān),隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，我們發(fā)現(xiàn)了多種與dRTA相關(guān)的基因及其突變。目前已明確的遺傳性RTA的致病基因有：SLC4A1基因突變可引起遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒，多數(shù)表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，少數(shù)亦表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳(AR)；ATP6V1B1基因和ATP6V0A4基因突變均可導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性dRTA。
　　雖然我們對(duì)于原發(fā)性腎小管酸中毒的遺傳認(rèn)識(shí)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是仍然非常不夠。目前，國(guó)內(nèi)外尚缺乏大組的腎小管性酸

4、中毒的報(bào)道和分析，尤其是有關(guān)原發(fā)性RTA完整的基因篩查資料。SLC4A1基因編碼的AE1作為原發(fā)性遠(yuǎn)端RTA致病的最重要的一個(gè)基因。為提高對(duì)原發(fā)性RTA分子遺傳機(jī)制的認(rèn)識(shí)，本研究第一部分對(duì)包括散發(fā)以及家系的共58例原發(fā)性腎小管性酸中毒患者的進(jìn)行RTA相關(guān)SLC4A1基因進(jìn)行篩查并分析其突變，并且將篩查出致病突變的患者與未篩查出突變的患者行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　本研究第一部分對(duì)自1997年9月至2012年12月收集的58例原發(fā)性腎小管酸

5、中毒患者，其中特別包括12例家族性遠(yuǎn)端腎小管酸中毒家系的先證者行SLC4A基因突變篩查，并對(duì)篩查出突變與未篩查出突變的患者行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察他們的臨床表現(xiàn)與特征，以提高遺傳性腎小管酸中毒的診斷水平。這是國(guó)內(nèi)首次對(duì)較大樣本的原發(fā)性dRTA患者進(jìn)行SLC4A1基因的突變篩查。我們篩查出了三個(gè)已知致病突變(R589C，R589H，G609R），分別來(lái)自三個(gè)不同家庭的患者，均為雜合突變，突變率(5.17％,3/58)。發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的純合SNP（G

6、819H），三個(gè)已報(bào)道的雜合SNP(E72D，R384H)，亦分別來(lái)自四個(gè)不同家庭的患者。同時(shí)，我們把三個(gè)攜帶致病基因突變的患者（兩個(gè)嬰兒期發(fā)病，一個(gè)低齡兒童期發(fā)病），與未攜帶此突變的其余55個(gè)患者做了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)攜帶致病基因突變的患者具有發(fā)病更早，骨骼并發(fā)癥發(fā)病率高，腎臟鈣化發(fā)生率增加等特點(diǎn)。其次，血PH，血氯，血CO2結(jié)合率，尿PH值雖然P值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是總體趨勢(shì)可見攜帶致病基因突變的患者血PH值更低，尿PH值更高，血氯離子

7、濃度更高，血CO2更加低。因此，我們認(rèn)為因SLC4A1基因突變?cè)斐傻脑l(fā)性腎小管酸中毒的臨床癥狀要重于非SLC4A1基因突變?cè)斐傻哪I小管酸中毒，患病時(shí)間更早，酸中毒更明顯，腎臟鈣化以及骨病并發(fā)癥更常見。
　　值得注意的是：我們發(fā)現(xiàn)帶有 AE1突變的患者存在不同程度的腎小球性蛋白尿，這是因?yàn)殚L(zhǎng)期的腎小管損傷累計(jì)腎小球呢，還是有其他原因存在？查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)最近報(bào)道AE1在腎小球的足細(xì)胞上也有表達(dá)，AE1基因敲除小鼠在早期同樣會(huì)腎小

8、球性蛋白尿的產(chǎn)生，具體作用機(jī)制目前不甚清楚。另有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)免疫共沉淀中AE1和nephrin和ILK分別可以互相作用。因此，我們認(rèn)為AE1發(fā)生突變后，在足細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，或者與nephrin、ILK，或者他足細(xì)胞蛋白之間的相互作用發(fā)生障礙是完全可能的，這樣造成足細(xì)胞的損傷從而導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。這個(gè)猜測(cè)需要我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去研究和證明。
　　本研究第二部分對(duì)我們發(fā)現(xiàn)的SLC4A1的雜合變異R589C進(jìn)行功能研究。采用定點(diǎn)誘變構(gòu)

9、建成功含有R589C突變的SLC4A1-pIRES2-EGFP Vector質(zhì)粒。將野生型、突變型以及空載對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的 HEK293t細(xì)胞后，使用MQAE熒光染料觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度來(lái)間接觀察其離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能。其次，應(yīng)用免疫熒光法及共聚焦顯微鏡觀察 AE1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位及與高爾基體標(biāo)志物（GM130）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物（calnexin）的共定位情況；最后，分別使用細(xì)胞總蛋白以及膜蛋白提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染后野生型，突變型以

10、及空載對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白，用WESTERNBLOT方法觀察SLC4A1在細(xì)胞中以及細(xì)胞膜上的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的HEK293t細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度與未轉(zhuǎn)染的 HEK293t細(xì)胞相比明顯升高,但是突變型轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度仍然高于空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞，我們認(rèn)為突變型AE1離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能出現(xiàn)障礙，但是并非全部失功。野生型AE1蛋白與突變型與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物calnexin以及高爾基體標(biāo)志物GM130均能共定位。WESTERN結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后細(xì)

11、胞AE1總表達(dá)量野生型與突變型基本相似，膜蛋白表達(dá)量明顯減少，提示突變型AE1功能缺陷，功能缺陷的原因來(lái)自產(chǎn)生的蛋白未能成功轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上。值得注意的是AE1蛋白羧基端與CAII有著重要的互相作用，這對(duì)CAII發(fā)揮碳酸酐酶的作用非常關(guān)鍵，末端的突變可能破壞AEl與CAⅡ的正常結(jié)合而AE1蛋白的突變可能破壞其與CAII的正常結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)碳酸氫根的生成從而導(dǎo)致遠(yuǎn)端腎小酸化功能的障礙。AEl與CA11的結(jié)合位點(diǎn)位于點(diǎn)D887ADD(AEl第