原發(fā)性遠端腎小管酸中毒的致病基因SLC4A1的研究.pdf

1、腎小管性酸中毒（Renal Tubular Acidosis，RTA）系腎臟酸化功能障礙引起的以低血鉀、高血氯性代謝性酸中毒為特點的一組臨床綜合征，由遠端腎小管泌氫泌銨功能障礙或和近端腎小管對碳酸氫根離子重吸收障礙引起1。
　　腎小管酸中毒臨床上分成四型：遠端腎小管性酸中毒（Ⅰ型）；近端腎小管性酸中毒（Ⅱ型）；混合型腎小管性酸中毒（Ⅲ型）；高血鉀型腎小管性酸中毒（Ⅳ型）2。根據病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性常為先天性，遺傳性腎小

2、管功能缺陷；繼發(fā)性見于如干燥綜合征、肝炎病毒感染等疾病，或者因腎臟毒性藥物食物如由馬兜鈴酸類中草藥等引起3。
　　遠端腎小管性酸中毒（Distal renal Tubular Acidosis，dRTA），即I型腎小管酸中毒，也是最常見的一種，是由遠端腎小管分泌氫離子以及分泌銨離子功能障礙所致的代謝性酸中毒等一組綜合征，臨床特點為低血鉀、高氯性代謝性酸中毒、繼發(fā)性骨病、以及腎臟鈣化、結石等。
　　原發(fā)性遠端腎小管性酸中毒主要

3、與遺傳相關,隨著分子生物學理論和技術的發(fā)展，我們發(fā)現了多種與dRTA相關的基因及其突變。目前已明確的遺傳性RTA的致病基因有：SLC4A1基因突變可引起遠端腎小管性酸中毒，多數表現為常染色體顯性遺傳，少數亦表現為常染色體隱性遺傳(AR)；ATP6V1B1基因和ATP6V0A4基因突變均可導致常染色體隱性遺傳性dRTA。
　　雖然我們對于原發(fā)性腎小管酸中毒的遺傳認識有了長足的進步，但是仍然非常不夠。目前，國內外尚缺乏大組的腎小管性酸

4、中毒的報道和分析，尤其是有關原發(fā)性RTA完整的基因篩查資料。SLC4A1基因編碼的AE1作為原發(fā)性遠端RTA致病的最重要的一個基因。為提高對原發(fā)性RTA分子遺傳機制的認識，本研究第一部分對包括散發(fā)以及家系的共58例原發(fā)性腎小管性酸中毒患者的進行RTA相關SLC4A1基因進行篩查并分析其突變，并且將篩查出致病突變的患者與未篩查出突變的患者行統(tǒng)計學分析。
　　本研究第一部分對自1997年9月至2012年12月收集的58例原發(fā)性腎小管酸

5、中毒患者，其中特別包括12例家族性遠端腎小管酸中毒家系的先證者行SLC4A基因突變篩查，并對篩查出突變與未篩查出突變的患者行統(tǒng)計學分析，觀察他們的臨床表現與特征，以提高遺傳性腎小管酸中毒的診斷水平。這是國內首次對較大樣本的原發(fā)性dRTA患者進行SLC4A1基因的突變篩查。我們篩查出了三個已知致病突變(R589C，R589H，G609R），分別來自三個不同家庭的患者，均為雜合突變，突變率(5.17％,3/58)。發(fā)現一個新的純合SNP（G

6、819H），三個已報道的雜合SNP(E72D，R384H)，亦分別來自四個不同家庭的患者。同時，我們把三個攜帶致病基因突變的患者（兩個嬰兒期發(fā)病，一個低齡兒童期發(fā)?。?，與未攜帶此突變的其余55個患者做了統(tǒng)計學分析，發(fā)現攜帶致病基因突變的患者具有發(fā)病更早，骨骼并發(fā)癥發(fā)病率高，腎臟鈣化發(fā)生率增加等特點。其次，血PH，血氯，血CO2結合率，尿PH值雖然P值無統(tǒng)計學意義，但是總體趨勢可見攜帶致病基因突變的患者血PH值更低，尿PH值更高，血氯離子

7、濃度更高，血CO2更加低。因此，我們認為因SLC4A1基因突變造成的原發(fā)性腎小管酸中毒的臨床癥狀要重于非SLC4A1基因突變造成的腎小管酸中毒，患病時間更早，酸中毒更明顯，腎臟鈣化以及骨病并發(fā)癥更常見。
　　值得注意的是：我們發(fā)現帶有 AE1突變的患者存在不同程度的腎小球性蛋白尿，這是因為長期的腎小管損傷累計腎小球呢，還是有其他原因存在？查閱相關文獻，發(fā)現最近報道AE1在腎小球的足細胞上也有表達，AE1基因敲除小鼠在早期同樣會腎小

8、球性蛋白尿的產生，具體作用機制目前不甚清楚。另有文獻發(fā)現免疫共沉淀中AE1和nephrin和ILK分別可以互相作用。因此，我們認為AE1發(fā)生突變后，在足細胞膜上的轉運發(fā)生障礙，或者與nephrin、ILK，或者他足細胞蛋白之間的相互作用發(fā)生障礙是完全可能的，這樣造成足細胞的損傷從而導致蛋白尿的產生。這個猜測需要我們進一步的實驗去研究和證明。
　　本研究第二部分對我們發(fā)現的SLC4A1的雜合變異R589C進行功能研究。采用定點誘變構

9、建成功含有R589C突變的SLC4A1-pIRES2-EGFP Vector質粒。將野生型、突變型以及空載對照質粒轉染體外培養(yǎng)的 HEK293t細胞后，使用MQAE熒光染料觀察轉染后的細胞內氯離子濃度來間接觀察其離子轉運功能。其次，應用免疫熒光法及共聚焦顯微鏡觀察 AE1蛋白在細胞內的定位及與高爾基體標志物（GM130）和內質網標志物（calnexin）的共定位情況；最后，分別使用細胞總蛋白以及膜蛋白提取試劑盒提取轉染后野生型，突變型以

10、及空載對照質粒轉染細胞的蛋白，用WESTERNBLOT方法觀察SLC4A1在細胞中以及細胞膜上的表達情況。我們發(fā)現轉染野生型質粒的HEK293t細胞內氯離子濃度與未轉染的 HEK293t細胞相比明顯升高,但是突變型轉染細胞內氯離子濃度仍然高于空載轉染細胞，我們認為突變型AE1離子轉運功能出現障礙，但是并非全部失功。野生型AE1蛋白與突變型與內質網標志物calnexin以及高爾基體標志物GM130均能共定位。WESTERN結果表明轉染后細

11、胞AE1總表達量野生型與突變型基本相似，膜蛋白表達量明顯減少，提示突變型AE1功能缺陷，功能缺陷的原因來自產生的蛋白未能成功轉運到細胞膜上。值得注意的是AE1蛋白羧基端與CAII有著重要的互相作用，這對CAII發(fā)揮碳酸酐酶的作用非常關鍵，末端的突變可能破壞AEl與CAⅡ的正常結合而AE1蛋白的突變可能破壞其與CAII的正常結合導致細胞內碳酸氫根的生成從而導致遠端腎小酸化功能的障礙。AEl與CA11的結合位點位于點D887ADD(AEl第