雞尾酒療法作用肝星狀細胞的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景:肝纖維化是由各種致病因子所引起的組織修復(fù)過程，主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)過度沉積，它是肝硬化乃至肝癌共同的病理基礎(chǔ)。因此，探尋有效治療肝纖維化的方法是非常必要和迫切的。近年來，許多研究證實肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，對抗肝纖維化藥物的研究也取得了一定的進展，但肝纖維化發(fā)生機制復(fù)雜，而著眼于阻斷發(fā)病機制某一環(huán)節(jié)的藥物治療見效不大。本研究小組前期應(yīng)用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、?；撬?Taurine)和三羥基異黃酮(Genist

2、ein)三種具有不同抗纖維化作用機理的藥物聯(lián)合組成雞尾酒(Cocktail)進行了一系列體內(nèi)外實驗，發(fā)現(xiàn)其具有抗肝纖維化作用。
　　 目的:本研究運用iTRAQ技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究雞尾酒作用肝星狀細胞株HSC-T6后，細胞的整體蛋白表達水平發(fā)生的變化，分析和鑒定細胞中差異表達的蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)水平探討雞尾酒療法抗肝纖維化的作用機理，以期為肝纖維化的診斷、治療和

3、預(yù)后尋找可靠的生物標(biāo)志物。
　　 方法:以HSC-T6作為靶細胞，經(jīng)Cocktail作用后，采用MTT法測定藥物對細胞增殖的影響，確定Cocktail對HSC-T6增殖抑制的最佳濃度;然后提取Cocktail最佳濃度作用下肝星狀細胞株HSC-T6的細胞總蛋白，用 bradford法定量蛋白質(zhì)濃度;取等量蛋白用胰蛋白酶(Trypsin)酶解，再以同位素標(biāo)簽的iTRAQ標(biāo)記蛋白質(zhì)肽段，經(jīng)陽離子柱(SCX)分離后，利用LC-ESI-M

4、S/MS進行質(zhì)譜檢測差異表達的蛋白質(zhì)，后采用Mascot進行IPI大鼠蛋白數(shù)據(jù)庫搜索鑒定蛋白質(zhì)，運用生物信息學(xué)分析差異表達的蛋白質(zhì)功能。
　　 結(jié)果:(1)雞尾酒療法對HSC-T6增殖有抑制作用，cocktail低、中、高劑量組與對照組的A值比較有顯著性差異(0.122±0.009，0.154±0.016，0.187±0.052 VS0.223±0.032，P＜0.05)，中劑量與低劑量之間無顯著差異，低劑量、中劑量與高劑量組間

5、有顯著差異;(2)質(zhì)譜共鑒定分析出727種蛋白質(zhì)。根據(jù)當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其p-value值小于0.05時，視為差異蛋白。與對照組相比，三次生物學(xué)重復(fù)鑒定到的差異蛋白數(shù)量分別:第一次實驗共發(fā)現(xiàn)285種差異表達的蛋白質(zhì)，其中119種蛋白質(zhì)上調(diào)，166種蛋白質(zhì)下調(diào);第二次重復(fù)實驗時共找到331種差異表達蛋白質(zhì)，其中126種蛋白質(zhì)上調(diào)，205種蛋白質(zhì)下調(diào);第三次重復(fù)實驗時發(fā)現(xiàn)330種差異表達蛋白質(zhì)，130種蛋白質(zhì)上

6、調(diào)，200種蛋白質(zhì)下調(diào)。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，三次生物學(xué)重復(fù)均鑒定到的差異蛋白為36個，其中表達上調(diào)的差異蛋白有11個，表達下調(diào)的差異蛋白有25個。通過對這些差異蛋白進行蛋白質(zhì)功能分析，發(fā)現(xiàn)其參與翻譯后修飾、轉(zhuǎn)錄、重組和信號傳導(dǎo)通路等過程。
　　 結(jié)論:(1)雞尾酒療法具有抑制HSC-T6增殖的作用，Cocktail低劑量組（taurine15μg/ml+EGCG17.5μg/ml+genistein3.5μg/ml）具有較好的抑制作用