肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移特性的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是威脅我國人民健康的重大疾病。在世界范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌居于男性患者癌癥發(fā)病率的第五位和死亡率的第二位，發(fā)展快，惡性程度高，預(yù)后差，素有癌癥之王的稱號。世界范圍內(nèi)，每年新增的肝細(xì)胞癌患者約為700,000例，主要集中在中國、東南亞地區(qū)以及撒哈拉以南的非洲國家，呈現(xiàn)顯著的地域分布的特征。在肝癌的致病因素中，乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是最重要的誘

2、發(fā)因素。病因統(tǒng)計(jì)顯示54％的肝癌患者與HBV的感染相關(guān)，而我國又是HBV感染高發(fā)區(qū)。由HBV感染所誘發(fā)引起的肝細(xì)胞癌的發(fā)病率占到男性癌癥發(fā)病率的7.5%和死亡率的5%。因此肝細(xì)胞癌的診斷與治療是中國亟待解決的重大安全衛(wèi)生問題。
　　當(dāng)前，肝癌的臨床治療包括根治性切除、移植、組織消融治療等一系列治療方法。雖然這些治療方法為肝細(xì)胞癌的治療帶來了一些希望，但肝細(xì)胞癌其本身的異質(zhì)性、復(fù)雜性仍舊給研究、治療肝細(xì)胞癌也帶來了巨大的困難。當(dāng)前面

3、臨兩個(gè)亟待解決的問題是早期正確、特異、高效診斷的困難和經(jīng)肝癌的根治性切除后患者的高復(fù)發(fā)率的問題。早期的肝細(xì)胞癌患者具有更好治療效果，能夠顯著提高肝癌患者的生存率并降低肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率，故早診是應(yīng)對肝細(xì)胞癌的重要途徑之一。而目前常用的肝細(xì)胞癌的早期診斷的診斷標(biāo)志物例如甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein,AFP）仍有部分假陽性或假陰性的問題，故肝細(xì)胞癌的早期診斷和精準(zhǔn)分期急需尋找新的、基于信號通路的特異性好、靈敏度高的生物

4、標(biāo)志物或其組合。
　　現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一般認(rèn)為，癌癥的發(fā)生是由于機(jī)體內(nèi)的基本細(xì)胞調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)缺陷而導(dǎo)致的疾病。這種調(diào)節(jié)機(jī)制的喪失會導(dǎo)致細(xì)胞分裂和增殖的失控、細(xì)胞贅生以及轉(zhuǎn)移等癌癥疾病表型的發(fā)生。蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)與腫瘤的這些行為的深層機(jī)制密切相關(guān)。在細(xì)胞內(nèi)，泛素蛋白酶體途徑通過對某些蛋白的降解的調(diào)控，在多種細(xì)胞進(jìn)程中均起到至關(guān)重要的作用。癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長時(shí)間、多進(jìn)程的遞進(jìn)過程。而泛素蛋白酶體系統(tǒng)是一個(gè)多因子、多步驟的蛋白質(zhì)降解調(diào)控體

5、系，對這個(gè)體系中的不同因子的調(diào)控，是改變腫瘤發(fā)展進(jìn)程的重要的措施。對肝細(xì)胞癌中泛素蛋白酶體途徑的變化的研究也是肝細(xì)胞癌病理及治療方法研究的熱點(diǎn)之一。
　　本研究利用了實(shí)驗(yàn)室成熟的高覆蓋度、高靈敏度、高精度的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，對不同轉(zhuǎn)移能力的肝細(xì)胞癌患者的組織樣本以及不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系樣本進(jìn)行研究，探索肝細(xì)胞癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)存在顯著差異或失調(diào)的信號通路，以及在侵襲與轉(zhuǎn)移過程中肝癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的變化或失

6、調(diào)，從而發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌在侵襲與轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞內(nèi)各種進(jìn)程發(fā)生的變化，為探索肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供幫助。
　　我們首先選取了根據(jù)肝癌TNM分型表征進(jìn)行分期的不同病程階段三組明確的肝癌標(biāo)本，應(yīng)用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的高覆蓋定量蛋白質(zhì)組學(xué)組研究。我們共鑒定4620個(gè)蛋白質(zhì)，總定量蛋白數(shù)為3781。T1期癌組織與T1期癌旁組織相比，共篩選到差異表達(dá)蛋白330個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)，而表達(dá)下調(diào)的蛋白有198個(gè)。T2期癌組織與T1期癌旁組

7、織相比，共有356個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中172個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)，193個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)。而T3期癌組織與T1期癌旁組織相比，共篩選到差異表達(dá)蛋白387個(gè)，其中185個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，202個(gè)差異蛋白表達(dá)下調(diào)。這些差異蛋白分布在外源物質(zhì)代謝、維生素代謝、細(xì)胞凋亡、肝臟脂肪性變、上皮細(xì)胞癌、腫瘤細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、細(xì)胞擴(kuò)散與細(xì)胞粘附和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等相關(guān)通路，提示這些變化可能與肝癌的發(fā)展高度相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，相比于癌旁組織，F(xiàn)LNC蛋白的表達(dá)量在

8、癌組織中顯著上調(diào)，且隨著肝細(xì)胞癌疾病病程的發(fā)展其表達(dá)量逐漸升高。這一結(jié)果還被Western Blot和TCGA數(shù)據(jù)庫中50例肝癌的癌與癌旁樣本數(shù)據(jù)證實(shí)，提示該蛋白可作為肝細(xì)胞癌病程發(fā)展過程中的一個(gè)新的潛在生物標(biāo)志物。
　　在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們選取了具有不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系 Hep3B、MHCC-97L、MHCC-97H和HCC-LM6細(xì)胞系，利用實(shí)驗(yàn)室新近發(fā)展的基于人工雜種UBD的高效泛素化蛋白純化技術(shù)，結(jié)合翻譯后修飾鑒定的

9、方法探索了腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)尤其是泛素蛋白酶體途徑的變化與失調(diào)情況。共鑒定潛在的泛素化蛋白2569個(gè)，以Hep3B細(xì)胞系作為對照細(xì)胞系，97L、97H和LM6細(xì)胞與其進(jìn)行比較，97L/Hep3B組得到差異蛋白200個(gè)，其中上調(diào)蛋白109個(gè)，下調(diào)蛋白91個(gè)；97H/Hep3B組得到差異蛋白215個(gè)，其中上調(diào)蛋白109個(gè)，下調(diào)蛋白106個(gè)；LM6/Hep3B組得到差異蛋白97個(gè)，其中上調(diào)蛋白42個(gè)，下調(diào)蛋白55個(gè)。這些差異蛋白主要

10、集中在細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的整合素信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架信號通路、上皮細(xì)胞緊密連接重塑、CDC42相關(guān)信號通路、樁蛋白信號通路、RhoGDI信號通路、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的PI3K/AKT信號通路、EIF2信號通路以及ERK/MAPK信號通路、等。這是首次從泛素化修飾水平探索肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的嘗試。
　　綜上所述，本研究依托實(shí)驗(yàn)室成熟的高精度及高覆蓋度的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺、翻譯后修飾鑒定技術(shù)平臺，通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)中的iTRAQ技

11、術(shù)和翻譯后修飾鑒定技術(shù)，以不同轉(zhuǎn)移潛能的肝細(xì)胞癌患者的組織及細(xì)胞系樣本作為模型，進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，揭示了肝癌轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞分子水平及信號通路等的變化情況，建立了不同轉(zhuǎn)移能力肝癌組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜及不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系的泛素化修飾表達(dá)譜。并發(fā)現(xiàn) FLNC蛋白的表達(dá)量在癌組織中顯著上調(diào)，且隨著肝細(xì)胞癌疾病病程的發(fā)展其表達(dá)量逐漸升高，提示該蛋白可能是肝細(xì)胞癌病程發(fā)展過程中的一個(gè)新的潛在生物標(biāo)志物。本研究也為肝細(xì)胞癌的診斷與治療提供了新