基于外周血多參數聯合分析作為女性惡性腫瘤分子診斷方法的研究.pdf

1、目的:探索基于血清多參數聯合診斷用于鑒別女性惡性腫瘤與健康對照組的診斷價值，為臨床診斷提供一種分子輔助診斷方法。按照生物信息學方向流動，從不同的視角研究探索女性惡性腫瘤尤其是卵巢癌及乳腺癌的診斷模式，試圖篩選高靈敏、高特異的新的腫瘤生物標志物。
　　方法:收集卵巢腫瘤(Ovarian tumors)158例、卵巢癌（ovarian cancer）137例，卵巢良性腫瘤13例、卵巢交界性腫瘤8例及健康對照組40例，乳腺癌60例，乳腺

2、良性腫瘤20例，建立臨床數據庫。①流行病學調查及統(tǒng)計學分析卵巢癌臨床實驗室指標的差異;對生化指標及腫瘤標記物CA125及其余腫瘤標志物進行生物信息學分析。②采用曠博三步法的免疫熒光定量PCR方法測量乳腺癌中血清miRNA水平，分析了不同組間miRNA表達的差異。首先應用標準的miRNA提取方法。設定miRNA的內參、質控，在第一步，加多聚A尾，在miRNA和其他非編碼RNA分子的3'端。第二步，反轉錄miRNA為cDNA的并在5'端加特

3、異性標簽。最后，在一個特異性的miRNA的正向引物和反向通用引物組合的進行qPCR反應，并測量;③用基質輔助激光解離時間飛行質譜(MALDI-TOF-MS)繪制卵巢癌蛋白多肽圖譜，用MB-WCX磁珠優(yōu)化處理外周血清標本，用Clinprot軟件分析卵巢癌與健康對照的蛋白多肽差異，結合生物信息學技術分析，分別分析比較了卵巢癌不同分期、分級及病理類型的多肽表達差異;④Luminex液態(tài)芯片檢測血清中炎性因子GM-CSF、IFN-γ、GRO、I

4、L-1β、IL-2、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、VEGF、 EGF、RANTES、 CCL21/6Ckine和SDF-1/CXCL12等指標，比較其在卵巢漿液性上皮癌與健康對照組的差異，并探討其作為腫瘤標志物的預測價值。數據資料用SPSS19.0計算機統(tǒng)計軟件及ClinPro Tools軟件分析。
　　結果:①建立臨床數據庫;回顧分析了卵巢癌患者的病史資料特點，女性腫瘤標志物CEA,AFP, CA125,CA199

5、,CA153,CA724,SCC,NSE,HCG, CYFRA21-1,Ferr在卵巢癌組顯著上調，CA125表達最顯著，但僅有54％的患者CA125表達陽性，CA125表達陽性率隨期別升高而增高。CA153在診斷卵巢與健康對照組時的曲線下面積達到0.827，敏感性80.3％，但是，特異性為72.6％。CA125敏感性僅為64.3％，但特異性好，特異度為90.4％。CA125與CA153聯合診斷的曲線下面積可以達到0.877，敏感度上升

6、73.5％，而仍然保持良好的特異度90.5％。一些與代謝有關的生化指標顯著升高。如GGT、HDL、CK-MB、CO2、ALP、TG、CK-MB、均高于健康對照組。②miR-451，miR-148a，miR-27a，和miR-30b在乳腺癌患者血清中表達下調(miR-451:P=0.000; miR-148a: P=0.021; miR-27a: P=0.013 andmiR-30b: P=0.001)。miR-451，miR-27a和m

7、iR-30b在乳腺良性疾病中也下調miR-451:P=0.002; miR-27a: P=0.012和miR-30b: P=0.046。其中miR-451在這些指標中被認為敏感度最高，表達差異最大，可以被用來進行乳腺疾病與健康對照組的初篩，miR-148a在區(qū)別卵巢良性腫瘤和惡性腫瘤時有一定的意義。miR-451，miR-148a，miR-27a和miR-30b作為標志物集用于診斷乳腺癌，ROC工作曲線下面積可達到0.953，敏感性94

8、.7％，特異性82.8％。單一的miR-148a在區(qū)分卵巢良惡性腫瘤時，能夠達到56.1％的敏感性，78.9％的特異性，曲線下面積達69.8％。③卵巢癌不同病理類型、不同分期及分級的差異蛋白。4個差異多肽與卵巢癌的分級有關，分別為2884.4Da，2899.9 Da，3542.9 Da，2864.6 Da。其中2884.4Da峰差異最顯著，在高分化的卵巢癌中表達較高，在中分化、低分化組中表達明顯下調。8個多肽峰與卵巢癌的分期有關，在晚期

9、癌癥中表達上調的是2683.5Da，2661.3 Da，2670.6 Da，2952.0 Da，表達下調的是1532.7 Da，1980.3Da，2884.4 Da，1804.7 Da。同源的腫瘤，差異表達的多肽也少。建立回歸方程Y=0.691+0.398X2487-0.638 X1867，診斷價值最高，ROC曲線下面積為0.855，敏感度可達100％,特異度達到60.9％, Youden指數0.609。④卵巢癌組EGF, IL-6，M

10、CP-1，6Ckine的血清中值水平明顯升高，與健康對照組比較，而IL-2的血清水平在卵巢癌中下降。根據差異表達的各項因子多因素回歸后建立診斷方程Y=-3.707+0.009 XEGF+0.001XMCp+0.014 XCkine，診斷模型的敏感度為72.7％，特異度為83.8％，ROC曲線下面積為0.845。
　　結論:以女性腫瘤卵巢癌、乳腺癌臨床數據資料為基礎，采用目前比較前沿的分子診斷技術，整合基因組學、蛋白組學技術的生物信