內(nèi)皮素受體B多態(tài)性與SOX10表達(dá)在先天性巨結(jié)腸癥發(fā)病機(jī)制中作用研究.pdf

1、第一部分散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥內(nèi)皮素受體B基因多態(tài)性與突變的篩檢 [目的]篩檢內(nèi)皮素受體B易感基因在中國(guó)漢族散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥是否有突變與多態(tài)性，探討EDNRB與先天性巨結(jié)腸癥發(fā)病的關(guān)系。 [方法]采用病例對(duì)照研究方法，收集104例散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥外周血標(biāo)本，120例正常兒童作對(duì)照。鹽析法提取全部樣本DNA，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增內(nèi)皮素受體B的7個(gè)外顯子與內(nèi)外顯子交界區(qū)片段，單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法篩檢異常泳動(dòng)條帶來判斷突變與多

2、態(tài)性。 [結(jié)果]散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥EDNRB基因外顯子1，3，4，6和7均檢測(cè)到突變或多態(tài)性位點(diǎn)，突變以短段型為主，而外顯子2和5無此異常改變。 [結(jié)論]中國(guó)漢族散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥發(fā)病與內(nèi)皮素受體B密切相關(guān)，尤其短段型HD，多態(tài)性位點(diǎn)與突變可能影響受體功能。 第二部分散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥內(nèi)皮素受體B基因多態(tài)及突變類型的確定與分布 [目的]研究中國(guó)漢族散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥易感基因內(nèi)皮素受體B突變與多態(tài)性

3、特征，探討不同堿基改變與先天性巨結(jié)腸癥的發(fā)病關(guān)系。 [方法]收集104例散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥外周血標(biāo)本，以120例正常兒童作對(duì)照。鹽析法提取全部樣本DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增易感基因內(nèi)皮素受體B的7個(gè)外顯子與內(nèi)外顯子交界區(qū)片段，單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法篩檢異常泳動(dòng)條帶后，DNA直接測(cè)序確定突變與多態(tài)性位點(diǎn)，比較病例組與對(duì)照組多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型分布差異。 [結(jié)果]散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥患者EDNRB基因突變率為6.

4、7％(7/104)，4種突變方式，新發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn)為c711C＞A(2例)與c1157T＞G(2例)，c723T＞C(2例)與c1278T＞C(1例)為已報(bào)道突變點(diǎn)，分別位于外顯子3,6和7，6例為短段型，突變均為雜合體；共檢測(cè)5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，除c99C＞T(P33P)外，c311A＞T(N104I)、c831G＞A(L277L)、c1148C＞A(P383Q)及c1170C＞A(S390R)四個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率與基因型分布均差異顯著(P

5、＜0.05)，其中c1148C＞A位點(diǎn)攜帶CC基因型的羈患風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)8.2倍(95％CI3.1～21.7，P＜0.001)。 [結(jié)論]中國(guó)漢族散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥易感基因內(nèi)皮素受體B存在多種突變方式，以短段型為主且均為雜合體突變，突變與臨床表型存在異質(zhì)性；內(nèi)皮素受體B基因可檢測(cè)到5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，4個(gè)SNPs的等位基因頻率和基因型分布頻率在病例與對(duì)照組間差異顯著，與HD發(fā)病有明顯相關(guān)性，SNPs位點(diǎn)可用于評(píng)估羈患風(fēng)險(xiǎn)；不同種族sHD

6、的EDNRB基因遺傳特征存在差異。 第三部分散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥內(nèi)皮素受體B基因多態(tài)性及突變與雙親遺傳關(guān)系及HD易感性的研究 [目的]研究中國(guó)漢族散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥親子代間EDNRB基因突變與多態(tài)性的遺傳特征，并評(píng)估單體型與羈患風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。 [方法]收集104例散發(fā)性先天性巨結(jié)腸與其中42例患兒的雙親血樣，以120例正常兒童作對(duì)照，通過PCR-SSCP與DNA測(cè)序確定并比較EDNRB基因的突變與多態(tài)性位點(diǎn)基因型

7、與等位基因分布差異，以傳遞不平衡檢驗(yàn)(TDT)分析42個(gè)三樣本家系SNPs的傳遞不平衡，并分析sHD表型與SNPs的關(guān)聯(lián)；以單體型遺傳模式確定羈患風(fēng)險(xiǎn)。 [結(jié)果]sHD患兒EDNRB基因突變率6.7％(7/104)，3例屬種系突變，其中2例突變基因遺傳自未發(fā)病母親；檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5個(gè)cSNPs位點(diǎn)，TDT檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)親子代在c311A＞T和c1148C＞A兩個(gè)非同義SNP位點(diǎn)存在傳遞不平衡，患兒易感等位基因T(c311A＞T)、C(c11

8、48C＞A)頻率明顯比雙親高(P＜0.01)；SSA型在4個(gè)SNP位點(diǎn)與正常對(duì)照差異顯著，LSA型僅1個(gè)位點(diǎn)，并且SSA型在c831G＞A與c1170C＞A位點(diǎn)的等位基因頻率與LSA型差異顯著(P＜0.05)；c311A＞T與c1148C＞A兩個(gè)多態(tài)性之間存在連鎖不平衡，病例組單體型311A-1148A頻率明顯低于對(duì)照組(2.9％vs16.7％，P＜0.01)，提示此單體型對(duì)sHD具有保護(hù)作用，單體型311T-1148C頻率明顯高于對(duì)照

9、組(18.8％vs7.9％，P＜0.01)；與攜帶311A-1148A單體型基因型(311A-1148A/311A-1148C，311A-1148A/311A-1148A，311A-1148A/311T-1148C)比較，非311A-1148A單體型攜帶者羈患sHD的風(fēng)險(xiǎn)增加到8.2倍(OR=8.153，95％CI：3.057～21.741，P＜0.001)。 [結(jié)論]中國(guó)漢族人群散發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥EDNRB基因突變以種系突變

10、為主；sHD易感基因EDNRB存在5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，c311A＞T和c1148C＞A兩個(gè)SNPs位點(diǎn)親子代間存在傳遞不平衡，易感等位基因優(yōu)先傳遞；sHD的SSA表型比LSA表型與EDNRB基因的關(guān)聯(lián)性明顯；單體型311A-1148A能降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，具有保護(hù)作用，非311A-1148A單體型攜帶者羈患sHD的風(fēng)險(xiǎn)增加到8.2倍(OR=8.153，95％CI：3.057～21.741，P＜0.001)。 第四部分SOX10候選基因與散

11、發(fā)性先天性巨結(jié)腸癥相關(guān)性的研究 [目的]研究性別決定區(qū)Y基因相關(guān)高可變區(qū)基因10(SOX10)在散發(fā)性先天性巨結(jié)腸(sHD)組織中表達(dá)情況，分子基礎(chǔ)上探討SOX10在sHD發(fā)病機(jī)制中作用。 [方法]收集55例散發(fā)性先天性巨結(jié)腸手術(shù)標(biāo)本，以24例非HD的正常腸管作對(duì)照，通過半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)SOX10mRNA在不同病變腸管的轉(zhuǎn)錄水平，并分析其與臨床參數(shù)的關(guān)系。 [結(jié)果]SOX10在sHD

12、病變腸管與正常對(duì)照腸管的組織均有表達(dá)，狹窄段表達(dá)水平為(0.766±0.038)，明顯低于移行段(0.834±0.034)、擴(kuò)張段(0.829±0.030)及正常對(duì)照組(0.824±0.021)的表達(dá)(P＜0.01)，而移行段、擴(kuò)張段及正常對(duì)照間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；短段型狹窄段表達(dá)明顯高于長(zhǎng)段型((0.775±0.037)vs(0.752±0.036)，P＜0.05)。 [結(jié)論]SOX10基因表達(dá)異常與散發(fā)性先天性巨結(jié)