針對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的樹突狀細(xì)胞-腫瘤融合瘤苗研究.pdf

1、骨骼系統(tǒng)是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移常見的靶器官，多見于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、甲狀腺癌、腎癌等。骨轉(zhuǎn)移一旦發(fā)生其后果嚴(yán)重，會引起嚴(yán)重的疼痛，病理性骨折，嚴(yán)重的神經(jīng)壓迫癥狀及致命的高血鈣癥嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量及生存時間。乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤，約70％的乳腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移占乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的70％，是臨床上一種常見的嚴(yán)重疾病。然而醫(yī)學(xué)發(fā)展至今尚無有效的方法來預(yù)防和治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。姑息性的放療及手術(shù)治療偶爾被用

2、來縮小腫瘤大小，化療通常因為耐藥而導(dǎo)致失敗，因而迫切需要新的治療手段。
　　腫瘤生物治療被稱為除手術(shù)、化療、放療外的第四種腫瘤治療方式，顯示了良好的應(yīng)用前景。作為腫瘤生物治療研究熱點之一的樹突狀細(xì)胞（DendriticCell,DC）是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(AntigenPresentingCell,APC)，其在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮極其重要的作用。目前主要有倆種DC相關(guān)腫瘤疫苗的研究。第一種為荷載已知腫瘤抗原的DC腫

3、瘤疫苗，主要包括：腫瘤相關(guān)抗原肽負(fù)載DCs，腫瘤相關(guān)抗原蛋白負(fù)載DCs，及編碼腫瘤相關(guān)抗原(TumorAssociateAntigen,TAA)的核酸（Deoxyribonucleicacid,Ribonucleicacid,DNA,RNA）轉(zhuǎn)染DCs。其能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生靶向于腫瘤抗原肽的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CytotoxicTLymphocyte,CTL）應(yīng)答，但由于目前發(fā)現(xiàn)的特異性TAA非常有限，并且存在腫瘤抗原異質(zhì)性及人主要

4、組織相容性復(fù)合體（MajorHistocompatibilityComplex,MHC）分子多態(tài)性等問題，其臨床應(yīng)用受到很大限制。第二種為荷載整個腫瘤細(xì)胞抗原的DC疫苗，主要包括:DC荷載凋亡的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物、荷載腫瘤細(xì)胞的酸洗脫物、轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的RNA及DC/腫瘤細(xì)胞融合瘤苗等。此種DC疫苗無需鑒定TAA，其理論上可靶向于多種腫瘤抗原包括已知的及未知的，并能夠引發(fā)多克隆的CTL免疫應(yīng)答，因而極大的擴(kuò)大了DC疫苗的應(yīng)用范圍并提

5、高了其有效性。其中,DC/腫瘤細(xì)胞融合瘤苗與其它DC疫苗相比,制備簡單直接,并且有其獨特的優(yōu)勢，其可通過MHCI類途徑內(nèi)源性處理及遞呈腫瘤抗原并最終活化CD8+CTL(ClusterofDifferentiation,CD抗原決定簇)，其是抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，此外其也可通過MHCII類途徑處理抗并激活CD4+輔助性T細(xì)胞(Thelpercell,Th)，從而協(xié)助效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮作用。而凋亡腫瘤細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞裂解物及腫瘤細(xì)胞的酸洗脫

6、物荷載DC主要以MHCII類途徑遞呈抗原，活化CD4+Th細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC雖可通過MHCI類途徑進(jìn)行遞呈,但其需進(jìn)行體外RNA擴(kuò)增及有效DC轉(zhuǎn)染，技術(shù)要求及操作比較復(fù)雜。鑒于DC/腫瘤細(xì)胞融合策略的上述優(yōu)點，本課題采用細(xì)胞融合技術(shù)構(gòu)建DC/乳腺癌細(xì)胞融合疫苗。在融合疫苗策略中，自體腫瘤細(xì)胞被首選使用，因為其腫瘤抗原表達(dá)譜包括已知及未知的與荷瘤宿主匹配最佳。然而針對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者，其自體乳腺癌細(xì)胞獲得非常困難，因為大多患者

7、其原發(fā)病灶已不存在，繼發(fā)灶常為多發(fā)，因而無手術(shù)指征，即使通過手術(shù)獲取腫瘤組織，往往會因為原代培養(yǎng)時間長，過程復(fù)雜及病原菌污染等無法獲得足夠活力及數(shù)量的腫瘤細(xì)胞。為解決這一問題，本課題首次使用異體乳腺癌細(xì)胞系MCF7代替自體乳腺癌細(xì)胞與DC融合,實現(xiàn)將腫瘤抗原導(dǎo)入DC的目的,并研究其抗自體乳腺癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)。使其在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的應(yīng)用成為可能，并為DC/腫瘤細(xì)胞融合細(xì)胞的應(yīng)用開辟新的途徑。
　　目的：為使DC/腫瘤細(xì)胞融合瘤苗應(yīng)

8、用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者，本研究采用異體乳腺癌細(xì)胞MCF7代替自體乳腺癌細(xì)胞制備融合瘤苗并研究其體外抗腫瘤免疫效應(yīng)，以期為DC腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用開辟新的途徑。
　　方法：使用粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophageColony-StimulatingFactor,GM-CSF），白細(xì)胞介素4（Interleukin4,IL4）誘導(dǎo)乳腺癌患者外周血單個核細(xì)胞（PeripheralBloodMononuclea

9、rCell,PBMC）DC分化，使用電融合儀制備DC/MCF7融合細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析融合效率，激光共聚焦顯微鏡鑒定真實融合細(xì)胞。融合細(xì)胞與T（與DC同源）細(xì)胞共培養(yǎng)后，使用酶聯(lián)免疫吸附斑點(Enzyme-linkedimmunosorbentspot,Elispot)法檢測T細(xì)胞分泌伽瑪干擾素（Interferon-gamma，IFNγ）頻數(shù)，使用乳酸脫氫酶(LactateDehydrogenase,LDH)釋放法檢測效應(yīng)T細(xì)胞殺傷靶

10、細(xì)胞（自體乳腺癌細(xì)胞）能力。
　　結(jié)果：外周血經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后獲得具有典型形態(tài)及表型的DC，使用電融合儀制備DC/MCF7融合細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測融合效率為45％左右，激光共聚焦顯微鏡直接觀察到了雙陽性的融合細(xì)胞。T細(xì)胞在DC/MCF7融合細(xì)胞刺激下，可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞增殖簇，在接觸自體乳腺癌細(xì)胞時分泌高水平IFNγ，并能產(chǎn)生針對自體乳腺癌細(xì)胞的CTL效應(yīng)，并具有腫瘤抗原特異性及MHC限制性。此種免疫原性與DC/自體乳腺癌融合