腫瘤微環(huán)境響應(yīng)膠束的構(gòu)建及其對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤的治療作用研究.pdf

1、目的：
　　由于骨髓中血流緩慢，并含有大量生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此骨組織是乳腺癌和前列腺癌等癌癥的好發(fā)轉(zhuǎn)移部位之一。近年來(lái)對(duì)原發(fā)性乳腺癌的治療取得了較大的進(jìn)步，明顯延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，但同時(shí)也增加了乳腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的幾率，有大量研究表明超過(guò)60％的晚期乳腺癌患者會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。在骨轉(zhuǎn)移部位由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子直接激活破骨細(xì)胞，增加骨重吸收，使骨質(zhì)遭到嚴(yán)重破壞，并使骨基質(zhì)中的各種生長(zhǎng)因

2、子釋放到腫瘤組織中，促進(jìn)腫瘤迅速生長(zhǎng)；而腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)一步加劇了骨重吸收，形成腫瘤生長(zhǎng)與骨重吸收之間的惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響骨轉(zhuǎn)移瘤的預(yù)后。另外，腫瘤轉(zhuǎn)移到骨會(huì)引起一系列的骨相關(guān)事件，如骨痛、病理性骨折、高鈣血癥和脊髓壓迫等，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，縮短生存時(shí)間。由于骨組織特殊的生理結(jié)構(gòu)，硬度大、藥物滲透量低，使得化療的應(yīng)用和療效受到限制。阿霉素（DOX）是治療乳腺癌的有效藥物，但是其毒副作用顯著，因此開(kāi)發(fā)一種既能抑制骨的重吸收又能抑制骨轉(zhuǎn)移瘤

3、生長(zhǎng)的DOX高效遞藥系統(tǒng)，對(duì)于治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤具有重要意義。
　　方法：
　　1.以阿侖膦酸鈉（ALN）為骨靶向配體，以透明質(zhì)酸（HA）為腫瘤靶向配體兼膠束親水端材料，以聚乙二醇（PEG）為ALN和HA之間的橋聯(lián)劑，以聚天冬氨酸（ PASP）為膠束疏水端材料，三者之間通過(guò)腙鍵連接，制備 HA-PASP和ALN-HA-PASP，采用胱胺將 ALN-HA-PASP分子通過(guò)二硫鍵交聯(lián)，得到ALN-(HA-PASP)CL，并進(jìn)行結(jié)

4、構(gòu)鑒定。采用透析法制備載阿霉素（DOX）pH響應(yīng)膠束DOX@HA-PASP和DOX@ALN-HA-PASP，以及具有pH及氧化還原響應(yīng)的載DOX核殼交聯(lián)膠束DOX@ALN-(HA-PASP)CL。
　　2.通過(guò)改變溫度、蒸餾水量、疏水端比例、投藥量?jī)?yōu)化制備膠束的條件。
　　3.采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定膠束的載藥量（DL）、包封率（EE）、臨界膠束濃度（CMC）；采用zeta電位及納米粒度分析儀檢測(cè)膠束粒徑、zeta電位和穩(wěn)定性

5、；采用透射電鏡（TEM）觀察膠束形態(tài)。
　　4.利用透析法結(jié)合熒光分光光度計(jì)觀察膠束在不同介質(zhì)中的釋藥特性。
　　5.利用活體成像儀觀察骨碎片對(duì)膠束的吸附和解吸附。
　　6.MTT法測(cè)定載藥膠束對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性；利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察MDA-MB-231細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞對(duì)膠束的攝取。
　　7.在體外采用新生小鼠顱骨和MDA-MB-231細(xì)胞在無(wú)菌條件下共孵育構(gòu)建乳腺癌骨

6、轉(zhuǎn)移瘤3D模型，通過(guò)掃描電鏡（SEM）判斷載藥膠束對(duì)骨重吸收的影響；通過(guò)中性紅染色觀察載藥膠束對(duì)破骨細(xì)胞活性的影響；通過(guò)中性紅硝酸銀復(fù)染觀察載藥膠束作用后對(duì)骨重吸收程度的影響；通過(guò)結(jié)晶紫染色觀察載藥膠束對(duì)骨轉(zhuǎn)移瘤模型中腫瘤細(xì)胞抑制情況。
　　8.通過(guò)骨髓腔注射MDA-MB-231細(xì)胞建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤裸鼠模型，通過(guò)測(cè)定荷瘤裸鼠體重，腫瘤體積及H&E切片染色評(píng)價(jià)載藥膠束的體內(nèi)抗腫瘤活性及體內(nèi)系統(tǒng)毒性；利用活體成像儀和冰凍切片觀察給藥

7、后 DOX在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況；通過(guò)Micro-CT觀察腫瘤部位骨質(zhì)的破壞程度。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)1H NMR和IR鑒定，所合成的HA-PASP、ALN-HA-PASP和ALN-(HA-PASP)CL為目標(biāo)產(chǎn)物。
　　2.在溫度為80C，蒸餾水量為30 mL，疏水端PASP投料量為30%，材料與藥物投量比為10:3（mg/mg）的條件下，通過(guò)透析法制備出的三種膠束DOX@HA-PASP， DOX@ALN-H

8、A-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL粒徑分別為95.3±7.2 nm，101.5±10.3nm和110.8±9.2 nm；zeta電位分別為-19.0±3.4mV，-13.9±4.1mV和-16.3±2.7mV；載藥量分別為11.3±2.7%，9.8±2.4%和14.6±3.2%；TEM結(jié)果顯示三種膠束均呈球形。
　　3.DOX@ALN-HA-PASP在pH5.0的介質(zhì)中，10 h內(nèi)累積釋藥量為90%；在pH7.4

9、的介質(zhì)中，10 h內(nèi)的累積釋藥量為35%，表明DOX@ALN-HA-PASP體外釋藥具有酸敏性。DOX@ALN-(HA-PASP)CL在0.1μM GSH（pH7.4）介質(zhì)中，60 h內(nèi)的累積釋藥量為35%；在10 mM GSH（pH7.4）和0.1μM GSH（pH5.0）兩種條件下，60 h內(nèi)的累積釋藥量均為60%左右，而在10 mM GSH（pH5.0）中，60 h內(nèi)的累積釋藥量高達(dá)90%，說(shuō)明DOX@ALN-(HA-PASP)C

10、L體外釋藥具有酸敏性和GSH敏感性。
　　4.骨碎片對(duì)經(jīng)ALN修飾DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL的吸附作用明顯高于未經(jīng) ALN修飾的 DOX@HA-PASP。DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL在pH5.0的條件下有良好的骨解吸附性。利用熒光分光光度計(jì)觀察到在pH5.0的酸性環(huán)境下膠束表面ALN脫落，提示膠束從骨表面解吸附是由于ALN脫落造成。
　　5

11、.相比于DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL，MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)DOX@HA-PASP的攝取最多，DOX@HA-PASP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞毒性最強(qiáng)；在 pH6.5的條件下，細(xì)胞能增加對(duì) DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL的攝取；另外，添加游離HA能夠減少M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞對(duì)DOX@HA-PASP的攝取。上述結(jié)果提示HA在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝取膠束

12、以及增強(qiáng)膠束的細(xì)胞毒性方面發(fā)揮重要的作用。
　　6.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察RAW264.7細(xì)胞對(duì)膠束的攝取，結(jié)果顯示RAW264.7細(xì)胞對(duì)DOX@ALN-HA-PASP的攝取量明顯少于DOX@HA-PASP，說(shuō)明ALN-PEG修飾能有效減少巨噬細(xì)胞的吞噬。
　　7.采用流式細(xì)胞術(shù)觀察到網(wǎng)格蛋白攝取途徑抑制劑蔗糖可明顯減少M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞對(duì)膠束的攝取，說(shuō)明膠束是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞被MDA-MB-231細(xì)胞所攝取。

13、>　　8.體外骨轉(zhuǎn)移瘤3D模型結(jié)果顯示DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性，發(fā)揮良好的抗骨重吸收以及抑制腫瘤細(xì)胞活性的作用。
　　9.體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOX@ALN-(HA-PASP)CL抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用明顯強(qiáng)于DOX@HA-PASP和DOX@ALN-HA-PASP；從H&E染色結(jié)果可以看出DOX有明顯的心臟毒性，而DOX@ALN-(HA-PASP)CL和DOX@AL

14、N-HA-PASP幾乎沒(méi)有心臟毒性，且DOX@ALN-(HA-PASP)CL對(duì)腫瘤組織的毒性最強(qiáng)；活體成像和冰凍切片結(jié)果顯示，DOX@ALN-HA-PASP和DOX@ALN-(HA-PASP)CL對(duì)骨轉(zhuǎn)移瘤有良好的靶向作用，同時(shí)降低 DOX在其他正常組織的分布；Micro-CT結(jié)果顯示，經(jīng)DOX@ALN-(HA-PASP)CL治療后，骨轉(zhuǎn)移瘤處的骨組織完整，與正常組之間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明DOX@ALN-(HA-PASP)CL抑制骨重吸收