δEF1調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和骨轉(zhuǎn)移的功能研究.pdf

1、第一部分：δEF1在乳腺癌細(xì)胞增殖中的功能研究
　　 乳腺癌是女性最常見(jiàn)的多發(fā)惡性腫瘤之一，無(wú)限增殖是幾乎所有腫瘤細(xì)胞的特征之一，乳腺癌也毫不例外，乳腺癌細(xì)胞的異常增殖以及隨后發(fā)生的轉(zhuǎn)移過(guò)程所涉及的生物學(xué)過(guò)程及其原理尚不很清楚，這嚴(yán)重影響了乳腺癌的預(yù)防和治療進(jìn)展。δEF1(δ-crystallin enhancer-binding factor1)隸屬于一類鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子超家族，具有廣泛的轉(zhuǎn)錄抑制功能。該轉(zhuǎn)錄抑制功能主要依靠

2、其兩端的鋅指結(jié)構(gòu)簇與被調(diào)控基因的上游啟動(dòng)子中E2-box的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。雖然已知δEF1是癌細(xì)胞增殖和分化的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，但是關(guān)于它在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程中的潛在功能還不是很清楚。
　　 我們用CCK-8試劑盒和Brdu參入流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法研究δEF1在乳腺癌細(xì)胞周期中的作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中過(guò)表達(dá)δEF1蛋白，可以明顯促進(jìn)細(xì)胞數(shù)目的增多；敲除掉內(nèi)源的δEF1，則反之。BrdU處理并用流式

3、細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)在MDA-MB-231細(xì)胞中，δE目的過(guò)表達(dá)可以非常明顯使細(xì)胞周期處于S期的細(xì)胞的數(shù)目增加；用RNA干擾技術(shù)敲除掉δEF1，則可以得到相反的效果，這就說(shuō)明δEF1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞G1-S期的轉(zhuǎn)換。
　　 在初步證實(shí)了δEF1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞從G1向S期的轉(zhuǎn)化的情況下，我們進(jìn)一步對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了研究：在MDA-MB-231細(xì)胞中過(guò)表達(dá)δEF1，無(wú)論在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平，均可看到CDK2和CDK4表達(dá)量的

4、增加，p21表達(dá)量得減少。如果敲除掉內(nèi)源性的δEF1，則CDK2和CDK4的表達(dá)量明顯減少，p21的表達(dá)量明顯被上調(diào)。
　　 這就證實(shí)在MDA-MB-231細(xì)胞中δEF1可以下調(diào)p21的表達(dá)，同時(shí)可以上調(diào)CDK2和CDK4的表達(dá)。為了進(jìn)一步分析8EF1在轉(zhuǎn)錄水平是怎樣調(diào)控p21的表達(dá)，首先，我們構(gòu)建了一系列不同截短長(zhǎng)度的人p21啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體，并用網(wǎng)上的在線工具TRANSFAC和TESS，對(duì)人p21啟動(dòng)子進(jìn)行了分析，結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)在人p21啟動(dòng)子-545/-540處存在一個(gè)E2-box(CAGGTG)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)和CHIP實(shí)驗(yàn)均證實(shí)δEF1通過(guò)結(jié)合到p21啟動(dòng)子的E2-box上，從而抑制p21的轉(zhuǎn)錄。
　　 我們又在雌激素受體ER陰性的MDA-MB-231，ER陽(yáng)性的MCF-7、ZR-75-1、T47-D四種人乳腺癌細(xì)胞中用實(shí)時(shí)定量PCR和western blot方法檢測(cè)到δEF1和p21表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步在22例人乳腺癌組織臨床標(biāo)本中，

6、實(shí)時(shí)定量PCR也檢測(cè)δEF1和p21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這都支持δEF1通過(guò)調(diào)控p21的表達(dá)從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　 綜上所述，在乳腺癌細(xì)胞中，δEF1通過(guò)下調(diào)p21的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)CDK2和CDK4的表達(dá)雙重機(jī)制促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。δEF1對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控方面的研究，必將為我們?nèi)绾畏乐稳橄侔┨峁┮恍┬碌乃悸贰?br>　　 第二部分：δEF1在乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移中的功能研究
　　 在乳腺癌轉(zhuǎn)移的很多階段

7、中，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化EMT是癌細(xì)胞擴(kuò)散機(jī)制的基礎(chǔ)，δEF1是含有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員，在乳腺癌EMT和骨重建中起著重要的作用。
　　 我們發(fā)現(xiàn)δEF1在具有高遷移傾向的MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)量較高，在具有低遷移傾向的MCF-7、T47-D和ZR-75-1細(xì)胞中表達(dá)量較低，并且在MDA-MB-231中過(guò)表達(dá)8EF1可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而敲除掉內(nèi)源性的δE目的表達(dá)，則乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲會(huì)

8、受到抑制。
　　 骨是乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要靶器官之一，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生往往伴隨著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的紊亂。因此我們研究了MDA-MB-231細(xì)胞中δEF1表達(dá)的變化對(duì)乳腺癌誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞成熟，成骨細(xì)胞成熟和鈣沉積的影響。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)δE目的MDA-MB-231細(xì)胞條件培養(yǎng)基不僅具有較高的誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TRACP活性的能力，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化；而且可以抑制BMP-2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞ALP活性的升高，以及

9、抑制BMP-2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞中osterix和骨鈣素的表達(dá)增加，從而抑制成骨細(xì)胞的成熟；還可以減少M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞被茜素紅染色的細(xì)胞數(shù)從而抑制成骨細(xì)胞的鈣沉積。這就證實(shí)用過(guò)表達(dá)δE目的MDA-MB-231中收集的條件培養(yǎng)基可以明顯的誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟，并且同時(shí)抑制成骨細(xì)胞的分化和礦化：另一方面，敲除δEF1表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞的條件培養(yǎng)基則表現(xiàn)出相反的作用。
　　 為了探索δEF1在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的具體分子機(jī)

10、制，我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在MDA-MB-231細(xì)胞中，δEF1從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平都可以顯著的上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-1 MMP-1的表達(dá)。用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)TESS分析MMP-1的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)在-70/-60的位置存在了一個(gè)AP-1位點(diǎn)(CATGAGTCAG)，熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TPA可以上調(diào)MMP-1啟動(dòng)子的活性，而姜黃素(Curcumin)可以抑制MMP-1啟動(dòng)子的活性。而TPA，Curcumin和δEF1對(duì)人MMP-1啟動(dòng)子突變后的AP-

11、1元件完全沒(méi)有任何作用響應(yīng)。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)δEF1可以明顯的使內(nèi)源性的MMP-1啟動(dòng)子募集到更多的AP-1成員c-Jun/c-Fos。熒光素酶實(shí)驗(yàn)和CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證實(shí)δEF1通過(guò)MMP-1啟動(dòng)子上的AP-1應(yīng)答元件激活其啟動(dòng)子的活性。
　　 AP-1的組成元件已被證明是MAPK信號(hào)通路的下游分子，Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)δEF1可以顯著激活MDA-MB-231細(xì)胞中JNK信號(hào)通路，并且熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明特異性J