核因子-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑在特發(fā)性脊柱側(cè)凸發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[背景]
　　 脊柱側(cè)凸是常見的脊柱畸形，通常發(fā)生于青春發(fā)育期，女性多見，若不及時(shí)診治，部分病人將會(huì)發(fā)展加重，引起軀體嚴(yán)重畸形，不但影響心肺功能、導(dǎo)致截癱，還會(huì)給患兒心理健康造成嚴(yán)重危害。該病發(fā)病率由于診斷手段和標(biāo)準(zhǔn)的差異，一般認(rèn)為在2％左右。在所有患者中，80％的患者病因不明，被稱之為“特發(fā)性脊柱側(cè)凸(Idiopathic Scoliosis，IS)”，由于這種疾病常常發(fā)生于青少年，因此也叫青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(Adolesc

2、ent Idiopathic Scoliosis，AIS)。盡管脊柱側(cè)凸臨床上已診治多年，但是發(fā)病機(jī)制尚不清楚。針對(duì)脊柱側(cè)凸的病因，近年來，國(guó)內(nèi)外就其遺傳、生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)肌肉、激素、結(jié)締組織等方向做了大量的研究。尤其是遺傳基因的研究最為熱門，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在IS的遺傳模式和易感基因方面均取得了一些列的進(jìn)展，但目前為止，還沒有哪一個(gè)研究成果能夠真正被學(xué)術(shù)界廣泛接受。最近有報(bào)道，核因子-kappa B(NF-κB)信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育方

3、面、細(xì)胞凋亡等方面同樣起著重要作用。該因子是細(xì)胞中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，靜息狀態(tài)下與IκB相結(jié)合形成復(fù)合體，以無活性狀態(tài)存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素刺激時(shí)，NF-κB暴露出核定位信號(hào)(NLS)進(jìn)入核內(nèi)，使其具有生物活性。目前研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在褪黑素的合成、調(diào)節(jié)等方面均產(chǎn)生作用，并且相互影響，其初步研究符合特發(fā)性脊柱側(cè)凸的臨床特征。
　　 [目的]
　　 人們不能完全解釋其確切發(fā)病原因，實(shí)際上“脊柱側(cè)凸”只是一個(gè)癥

4、狀診斷，短期內(nèi)對(duì)該疾病進(jìn)行病因診斷為時(shí)尚早，還需要大量的工作。結(jié)合臨床實(shí)際觀察特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者同時(shí)具有其他異常的比例也很高，如:神經(jīng)系統(tǒng)異常、生長(zhǎng)發(fā)育快速、三尖瓣返流、骨質(zhì)缺乏等等。因此，本人推測(cè)特發(fā)性脊柱側(cè)凸可能是一個(gè)全身性疾病的局部表現(xiàn)。同時(shí)NF-κB在細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡以及應(yīng)激因子的釋放等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，如果NF-κB信號(hào)通路異常，將導(dǎo)致全身性的異常，這種結(jié)果與特發(fā)性脊柱側(cè)凸合并的其他表現(xiàn)類似。對(duì)褪黑素與核因子κB之間的關(guān)

5、系及其調(diào)控因素的研究可能是解釋IS發(fā)病機(jī)制的突破口。本課題擬在前期工作的基礎(chǔ)上，在分子生物學(xué)水平，從信號(hào)傳導(dǎo)角度，深入研究核因子κB在特發(fā)性脊柱側(cè)凸發(fā)病中的作用、相互關(guān)系和機(jī)制，不但能進(jìn)一步加深對(duì)特發(fā)性脊柱側(cè)凸病因的認(rèn)識(shí)，也可以為臨床從根本上預(yù)防特發(fā)性脊柱側(cè)凸的發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和新的治療策略。本課題研究通過加深對(duì)特發(fā)性脊柱側(cè)凸發(fā)病機(jī)制的了解，找到干擾其發(fā)生發(fā)展的治療手段，如采用靜脈注射NF-κB的反義寡核苷酸抑制NF-κB的活性，以

6、控制特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者病情的進(jìn)展，為特發(fā)性脊柱側(cè)凸這一頑癥從根本上找到新的有效防治方法。若該類研究成果能最終應(yīng)用于臨床，將可以降低發(fā)病率，從源頭上控制病情，減輕社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)，降低醫(yī)療支出，增加生產(chǎn)力和社會(huì)效益。
　　 [方法]
　　 1.臨床研究
　　 以特發(fā)性脊柱側(cè)凸和非特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者（如先天性脊柱側(cè)凸或神經(jīng)纖維瘤病性脊柱側(cè)凸）為對(duì)象進(jìn)行研究。
　　 (1)臨床患者NF-κB活性的檢測(cè):

7、　　 抽血取樣，并于前路和后路手術(shù)取脊柱骨（椎板、棘突、椎體終板）和軟組織（椎間盤、各種韌帶、椎旁?。?biāo)本，比較不同類型脊柱側(cè)凸患者脊柱兩側(cè)的NF-κB濃度及NF-κB p65亞基mRNA表達(dá)水平。
　　 (2)觀察臨床患者褪黑素水平及其受體基因表達(dá)與NF-κB之間的關(guān)系:
　　 包括夜間褪黑素水平檢測(cè)以及通過術(shù)中取材檢測(cè)患者不同部位的褪黑素受體mRNA表達(dá)水平，并將結(jié)果與NF-κB檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。
　　

8、 (3)觀察上述檢測(cè)結(jié)果與患者臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 患者的側(cè)凸類型（特發(fā)性及非特發(fā)性）、形態(tài)（彎曲發(fā)生的不同部位:胸彎、腰彎、胸腰段彎曲、胸腰椎雙主彎等）、柔韌度、嚴(yán)重程度、進(jìn)展速度等臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性研究。
　　 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 以雞特發(fā)性脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型為研究對(duì)象進(jìn)行研究。
　　 (1)制作動(dòng)物模型
　　 切除雛雞（孵化3天的小雞）松果體建立特發(fā)性脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型;
　　

9、 (2) NF-κB活性及含量的檢測(cè)
　　 檢測(cè)范圍包括不同時(shí)段內(nèi)白細(xì)胞、脊柱骨組織（椎板、棘突、椎體終板）和軟組織（脊髓、椎間盤、各種韌帶、椎旁肌）標(biāo)本的NF-κB濃度及NF-κB p65亞基mRNA表達(dá)水平。
　　 (3)觀察褪黑素水平及其受體基因表達(dá)與NF-κB之間的關(guān)系:
　　 按照對(duì)照組、切除松果體已發(fā)生脊柱側(cè)凸和未發(fā)生脊柱側(cè)凸的動(dòng)物進(jìn)行分組，測(cè)量其夜間褪黑素水平檢測(cè)以及不同部位的褪黑素受體mRNA表達(dá)

10、水平，并將結(jié)果與NF-κB檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。探討褪黑素與NF-κB在雞脊柱側(cè)凸發(fā)生中的相互聯(lián)系。
　　 (4)探討NF-κB反義寡核苷酸在調(diào)控NF-κB活性中的作用:
　　 以特發(fā)性脊柱側(cè)凸的動(dòng)物模型為研究對(duì)象，采用NF-κB反義寡核苷酸干預(yù)NF-κB的活性，觀察其調(diào)控NF-κB活性的效果。
　　 [結(jié)果]
　　 臨床研究
　　 1.臨床患者NF-κB活性的檢測(cè)
　　 (1)輕中度(C

11、obb＜60°)IS患者外周血、椎板、椎旁肌中NF-κB活性同非特發(fā)性側(cè)凸及正常組相比無明顯差別。
　　 (2)重度(Cobb≥60°)IS患者外周血、椎板中NF-κ B活性同非特發(fā)性側(cè)凸及正常組相比無明顯差別;但椎旁肌中NF-κ B活性升高。
　　 (3)RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證:重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中NF-κB活性較之非特發(fā)性側(cè)凸及正常組升高。
　　 (4)重度(Cobb≥60°)IS患者凹側(cè)

12、椎旁肌中NF-κ B活性較凸側(cè)高。
　　 2.臨床患者褪黑素水平及其受體基因表達(dá)與NF-κB之間的關(guān)系
　　 (1)輕中度(Cobb＜60°)IS患者外周血、椎板、椎旁肌中褪黑素水平同非特發(fā)性側(cè)凸及正常組相比無明顯差別。
　　 (2)重度(Cobb≥60°)IS患者外周血、椎旁肌中褪黑素濃度較之非特發(fā)性側(cè)凸及正常組低;但在椎板中無明顯差異。
　　 (3)Western-blot驗(yàn)證進(jìn)一步說明:重度(Cob

13、b≥60°)IS患者椎旁肌中褪黑素濃度較之非特發(fā)性側(cè)凸及正常組低。
　　 (4)重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中褪黑素水平與NF-kB活性呈負(fù)相關(guān)，但外周血中無此相關(guān)性。
　　 3.上述檢測(cè)結(jié)果與患者臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析
　　 (1)重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中褪黑素水平與胸彎型、側(cè)凸進(jìn)展、側(cè)凸嚴(yán)重度具有相關(guān)性。
　　 (2)重度(Cobb≥60°)IS患者椎旁肌中NF-κB水平與胸

14、彎型、側(cè)凸進(jìn)展、側(cè)凸嚴(yán)重度同樣具有相關(guān)性。研究結(jié)果提示:褪黑素及NF-κB在側(cè)凸發(fā)生過程中的作用尚不明確，但在其發(fā)展過程中起重要作用。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 1.建立脊柱側(cè)凸模型
　　 切除雛雞（孵化3天的小雞）松果體建立特發(fā)性脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型;本研究動(dòng)物模型成功建立，松果體切除組有65.4％出現(xiàn)側(cè)凸(Cobb＞10°)。術(shù)后發(fā)生側(cè)凸畸形的雞，畸形種類多種多樣，且術(shù)后3月，脊柱側(cè)凸角度進(jìn)一步加重。
　　

15、2.NF-κB活性及含量的檢測(cè)
　　 發(fā)生側(cè)凸的雞2周時(shí)血中的NF-κB濃度較對(duì)照組、未發(fā)生側(cè)凸的雞高;3個(gè)月時(shí)監(jiān)測(cè):血、椎板中濃度同對(duì)照組無明顯差異，椎旁肌中的NF-κB濃度較對(duì)照組、未發(fā)生側(cè)凸的雞高。
　　 3.觀察褪黑素水平及其受體基因表達(dá)與NF-κB之間的關(guān)系:
　　 2周時(shí)夜間褪黑素水平在切除松果體己發(fā)生脊柱側(cè)凸和未發(fā)生脊柱側(cè)凸的兩組動(dòng)物中均明顯降低，較對(duì)照組差異明顯;3個(gè)月時(shí)，各種組織中褪黑素水平仍較

16、低。
　　 研究結(jié)果提示:血中、骨組織中可能有其他因素參與代償機(jī)制，使得NF-κB活性恢復(fù)正常，也提示上述兩種因子可能對(duì)椎旁肌的影響最大。
　　 4.探討NF-κB反義寡核苷酸在調(diào)控NF-κB活性中的作用:
　　 結(jié)果顯示:脊柱側(cè)凸的雞，在使用反義寡核苷酸干預(yù)時(shí)，血、椎板、椎旁肌中NF-κB的活性均迅速降低。但是重復(fù)3次試驗(yàn)后，重復(fù)性不高，特異性比較差。
　　 [結(jié)論]
　　 本研究針對(duì)脊柱側(cè)凸這

17、一世界難題，以臨床特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者和雛雞脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)研究方法，以NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑為研究靶點(diǎn)，(1)觀察了臨床特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者血液及骨及軟組織NF-κB活性、褪黑素水平及其受體基因表達(dá)、并將組織學(xué)結(jié)果與患者臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析;(2)切除雛雞松果體建立特發(fā)性脊柱側(cè)凸動(dòng)物模型，檢測(cè)其組織NF-κB活性及含量、褪黑素水平及其受體基因表達(dá)、并將組織學(xué)結(jié)果與患者臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析;(3)以特發(fā)性脊柱側(cè)

18、凸的動(dòng)物模型為研究對(duì)象，檢測(cè)了采用NF-κB反義寡核苷酸干預(yù)NF-κB的活性。
　　 結(jié)果顯示:(1)特發(fā)性脊柱側(cè)凸發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，多因素作用的結(jié)果;(2)褪黑素及NF-κB在側(cè)凸發(fā)生過程中的作用不明確;(3)褪黑素及NF-κ B在側(cè)凸的發(fā)展過程中起著重要的作用;(4)褪黑素及NF-κB的重要作用位點(diǎn)是椎旁肌;(5)需要進(jìn)一步行基因水平的研究以闡述其機(jī)制。
　　 本課題擬在前期工作的基礎(chǔ)上，在分子生物學(xué)水平，從信號(hào)傳導(dǎo)角度