絨癌耐藥細(xì)胞株的建立及耐藥基因逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、該研究擬應(yīng)用基因工程技術(shù)將細(xì)胞因子基因(IL-2)導(dǎo)入已建立的絨癌耐藥細(xì)胞株,觀察細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)絨癌細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用.研究?jī)?nèi)容:一、建立絨癌耐藥細(xì)胞株,采用濃度遞增法和間歇誘導(dǎo)的方法,用5-Fu,MTX,VP-16誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞株JEG-3建立6個(gè)耐細(xì)胞株,JEG-3/Fu1,JEG-3/Fu2,JEG-3/MTX1,JEG-3/MTX2,JEG-3/VP1和JEG-3/VP2,采用MTT法測(cè)定耐藥細(xì)胞株對(duì)5-Fu,MTX,KSM

2、,VP-16和Taxol的耐藥指數(shù),用RT-PCR測(cè)定親本細(xì)胞及各耐藥細(xì)胞株耐藥相關(guān)基因(LRP,MRP,GST-π,DHFR,MDR-1)的表達(dá),比較各種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,群體細(xì)胞的倍半時(shí)間,分泌β-HCG的差異,以了解獲得性耐藥的機(jī)理.二、IL-2基因的轉(zhuǎn)染對(duì)絨癌耐藥細(xì)胞株耐藥性的影響.用RT-PCR的方法克隆人的IL-2基因,將IL-2基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中,提取質(zhì)粒,用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將IL-2基因轉(zhuǎn)入VP-16誘

3、導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株JEG-3/VP2中,用G418篩選含IL-2 DNA片段的單細(xì)胞克隆,檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)5-Fu,MTX,VP-16,KSM,TAXOL耐藥指數(shù)的變化,比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化,用流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞DNA的含量,比較細(xì)胞周期的變化.用RT-PCR的方法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的多種耐藥基因的表達(dá)情況.結(jié)論:1、JEG-3細(xì)胞株在誘導(dǎo)耐藥前,有多種耐藥基因MRP,LRP,GST-π,DHFR的共表達(dá),而無(wú)MDR-1的表

4、達(dá).用VP-16,5-Fu采用間歇誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)形成有耐藥細(xì)胞株MDR-1表達(dá)增強(qiáng),其它耐藥基因的表達(dá)無(wú)改變.用MTX誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞株及用VP-16,5-Fu持續(xù)誘導(dǎo)形成的耐藥細(xì)胞株無(wú)MDR-1的表達(dá),而各耐藥細(xì)胞株的R的表達(dá)與誘導(dǎo)前相比無(wú)明顯變化.2、采用MTX、VP-16及5-Fu誘導(dǎo)JEG-3耐藥建立的耐藥細(xì)胞株雖然藥基因的表達(dá)不同,但都有多藥耐藥現(xiàn)象,說(shuō)明不同的誘導(dǎo)方式,不同的藥物誘導(dǎo)同一細(xì)胞株獲得耐藥的機(jī)制各不相同.國(guó)外僅見(jiàn)有

5、用MTX誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞耐藥的報(bào)道,未見(jiàn)用5-Fu及VP-16誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞耐藥的報(bào)道.3、克隆了人IL-2基因,并且將人IL-2基因通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人絨癌的耐藥細(xì)胞株JEG-3/VP2,用G418篩選出單細(xì)胞克隆,用RT-PCR的方法在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)互IL-2 mRNA的表達(dá).4、誘導(dǎo)耐藥前JEG-3細(xì)胞無(wú)MDR1的表達(dá),用VP-16采用間歇誘導(dǎo)的方法建立的耐藥細(xì)胞株MDR1的表達(dá)增強(qiáng),對(duì)VP-16的耐藥指數(shù)為38.7,IL-2基因轉(zhuǎn)染耐藥