Genistein對絨癌耐藥細(xì)胞株JAR-MTX侵襲的影響及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、絨癌是一種高度惡性腫瘤，早期即可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致全身播散。自二十世紀(jì)60年代以來，隨著HCG監(jiān)測技術(shù)的發(fā)展和化學(xué)藥物的應(yīng)用，絨癌的臨床化療效果較好。但是化學(xué)藥物除了能殺傷腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞也有很強(qiáng)的毒副作用，因此限制了化學(xué)藥物的應(yīng)用。此外，部分絨癌病人可發(fā)生耐藥，一旦發(fā)生耐藥往往是多藥耐藥，對各種化學(xué)藥物均不敏感，病人預(yù)后極差，轉(zhuǎn)移是其主要死亡原因。 Genistein又名4，5，7一三羥基異黃酮，是大豆異黃酮的一種。流行病

2、學(xué)研究表明，Genistein能降低乳腺癌、前列腺癌、腸癌等腫瘤的發(fā)生率。許多體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，Genistein能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)分化、抑制腫瘤血管新生和蛋白酪氨酸激酶的活性，而對造血細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞等正常組織細(xì)胞無明顯的毒副作用。近年來體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Genistein能抑制乳腺癌、纖維肉瘤和黑色素瘤細(xì)胞的侵襲，但其機(jī)制尚不清楚。本文旨在研究Genistein對絨癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及對

3、絨癌耐藥細(xì)胞株侵襲能力的影響，探討影響絨癌耐藥細(xì)胞侵襲的相關(guān)機(jī)制，以期尋求一種安全低毒的化療輔助藥物。 本課題共分三部分： 1、Genistein對絨癌細(xì)胞株JAR生物學(xué)行為的影響； 2、Genistein對絨癌耐藥細(xì)胞株JAR／MTX增殖、凋亡和侵襲的影響及作用機(jī)制； 3、ER-B在Genistein抑制絨癌耐藥細(xì)胞株JAR／MTX侵襲中的作用。 第一部分Genistein對絨癌細(xì)胞株JAR生物

4、學(xué)行為的影響 目的：了解Genistein對絨癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖、分化、細(xì)胞周期、凋亡和侵襲的影響。 方法：在絨癌細(xì)胞JAR的培養(yǎng)基中加入不同濃度的Genistein，每隔24h吸培養(yǎng)上清，測HCG的含量。采用MTT比色法檢測不同濃度Genistein對JAR細(xì)胞增殖的影響。采用HE染色、電鏡、流式細(xì)胞術(shù)和transwe¨法檢測JAR細(xì)胞經(jīng)Genistein處理72h，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化及Genistein對細(xì)胞

5、周期和運(yùn)動、侵襲能力的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，JAR細(xì)胞經(jīng)Genistein處理48h，于裸鼠背部接種皮下移植瘤，觀察成瘤率的變化。結(jié)果Genistein能抑制絨癌細(xì)胞JAR的增殖，且具有時間、劑量依賴關(guān)系。lOOnmol／mlGenistein使JAR細(xì)胞HCG分泌量增加，并呈時間依賴性。與對照組比較，lO、25、50和100nmol／ml處理組細(xì)胞侵襲能力分別下降一14．1％(P>O．05)、75．6％(P

6、05)和100％(P

7、制絨癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)HCG分泌，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯并抑制絨癌細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲能力。 第二部分 目的：了解Genistein對絨癌耐藥細(xì)胞株JAR／MTX增殖、凋亡和侵襲能力的影響，并探討侵襲的相關(guān)機(jī)制。方法分別采用MTT法、Annxin—V和PI雙染法、transwe¨小室法，檢測不同濃度Genistein作用于兒R／MTX細(xì)胞72h后細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的變化。采用RT一PCR技術(shù)檢測雌激素受體(ER)以及與侵襲有關(guān)

8、的MTA3、Snail基因mRNA的表達(dá)，并應(yīng)用蛋白印跡法和明膠酶譜法檢測E一鈣黏附蛋白(E—cd)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MIVIP一2)和9(MMP一9)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：Genistein能抑制JAR／MTX細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并呈劑量依賴關(guān)系。小劑量Genistein(10nmol／m1)僅能引起JAR／MTX細(xì)胞發(fā)生輕微的凋亡(16．85％)，而25、50、lOOnmol／mLGenistein則引起大量細(xì)胞發(fā)生凋亡(

9、54．84％，54．67％，47．50％)和壞死(28．59％，21．60％，44．12％)。與對照組比較，JAR／MTX細(xì)胞經(jīng)Genistein作用后，ERg和MTA3的mRNA表達(dá)量增加，Snail基因mRNA表達(dá)量減少。E—cd的蛋白表達(dá)增加，MMP一2和MMP一9的蛋白表達(dá)量減少。 結(jié)論：Genistein能抑制JAR／MTX細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，通過上調(diào)E—cd和下調(diào)MMP一2以及MMP一9的表達(dá)抑制JA

10、R／MTX細(xì)胞的侵襲能力，MTA3一Snail—E—cd通路可能是Genistein抑制JAR／MTX細(xì)胞侵襲的信號通路之一。 第三部分 目的：了解ER一B在Genistein抑制絨癌耐藥細(xì)胞株JAR／MTX細(xì)胞侵襲中的作用。 方法：分別采用transweU小室法、westernblot法、明膠酶譜法，檢測JAR／MTX細(xì)胞的ER-B經(jīng)RNA干擾后，不同濃度Genistein作用于JAR／MTX細(xì)胞72h后細(xì)胞侵

11、襲能力的變化，以及E—cd和MMP一2、MMP一9蛋白表達(dá)的變化。采用RT一PCR法檢測JAR／MTX細(xì)胞的ER一β經(jīng)RNA干擾后，50nmol／m16enistein作用于JAR／MX細(xì)胞0、1h、2h、4h、6h、8h后MTA3和Snail基因mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果：ER一B經(jīng)RNA干擾后，10和25hmol／mlGenistein抑制JAR／M似細(xì)胞侵襲(62％和72％)的作用被完全抑制(一19．9％和6．3％)，50

12、和100nmol／mlGenistein抑制JAR／MTX細(xì)胞侵襲(94％和96％)的作用也被部分抑制(68．7％和8L7％)。與對照組(1)比較，10{25、50和100nmol／ml6enistein上調(diào)E—cd表達(dá)(2．76、3．03、3．15和2．78倍)的作用均被抑制(O．94、O．97、1.00和1．05倍)，Genistein下調(diào)MMP一2和MMP一9的作用也受到抑制。與O點(diǎn)比較，Genistein上調(diào)MTA3和下調(diào)Sna